端粒 Telomeres 定义 端粒是染色体末端的DNA重复序列 端粒是

1、端粒Telomeres 定义端粒是 HYPERLINK /view/6633.htm t _blank 染色体末端的 HYPERLINK /view/758.htm t _blank DNA重复序列。端粒是染色体末端的一种特殊结构，在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。把端粒当作一件绒线衫袖口脱落的线段，绒线衫像是结构严密的DNA，排在线上的DNA决定人体性状。它们决定人头发的直与曲，眼睛的蓝与黑，人的高与矮等等，甚至性格的暴躁和温和。 功能稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接，并可补偿滞后链5末端在消除RNA引物后造成的空缺。组织培养的细胞证明，端粒在决定动植物细胞的寿命中起着重要

2、作用，经过多代培养的老化细胞端粒变短，染色体也变得不稳定。细胞分裂次数越多，其端粒磨损越多，寿命越短。 通常情况下，运动加速细胞的分裂，运动量越大，细胞分裂次数越多，因此寿命越短。所以体育运动一定要适可而止。组成端粒DNA是由简单的DNA高度重复序列组成的，染色体末端沿着5到3 方向的链富含 GT。在 HYPERLINK /view/83200.htm t _blank 酵母和人体中，端粒序列分别为C13A/TG13和TTAGGG/CCCTAA，并有许多蛋白与端粒DNA结合。端粒DNA主要功能有：第一，保护染色体不被 HYPERLINK /view/15636.htm t _blank 核酸酶

3、降解；第二，防止染色体相互融合；第三，为 HYPERLINK /view/213631.htm t _blank 端粒酶提供底物，解决DNA复制的末端隐缩，保证染色体的完全复制。端粒、着丝粒和复制原点是染色体保持完整和稳定的三大要素。同时，端粒又是基因调控的特殊位点, 常可抑制位于端粒附近基因的转录活性（称为端粒的位置效应，TPE）。在大多真核生物中，端粒的延长是由端粒酶催化的，另外，重组机制也介导端粒的延长。 发现之旅科学家们在寻找导致细胞死亡的基因时，发现了一种叫端粒的存在于染色体顶端的物质。端粒本身没有任何密码功能，它就像一顶高帽子置于染色体头上。在新细胞中，细胞每分裂一次，染色体顶端的

4、端粒就缩短一次，当端粒不能再缩短时，细胞就无法继续分裂了。这时候细胞也就到了普遍认为的分裂100次的极限并开始死亡。因此，端粒被科学家们视为“生命时钟”。 科学家由此又开始研究精子和癌细胞内的染色体端粒是如何长时间不被缩短的原因。1984年，分子生物学家在对单细胞生物进行研究后，发现了一种能维持端粒长度的端粒酶，并揭示了它在人体内的奇特作用：除了人类生殖细胞和部分体细胞外，端粒酶几乎对其他所有细胞不起作用，但它却能维持 HYPERLINK /view/335175.htm t _blank 癌细胞端粒的长度，使其无限制扩增。早在30年代，缪勒(Muller)和麦克林托克(Meclintock)

5、等就已发现了端粒结构的存在。1978年，四膜虫的端粒结构首先被测定。1990年起，凯文哈里(Calvin Harley)就把端粒与人体衰老挂上了钩：第一、细胞愈老，其端粒长度愈短；细胞愈年轻，端粒愈长，端粒与细胞老化有关系。衰老细胞中的一些端粒丢失了大部分端粒重复序列。当细胞端粒的功能受损时，就出现衰老，而当端粒缩短至关键长度后，衰老加速，临近死亡。第二、正常细胞端粒较短。细胞分裂会使端粒变短，分裂一次，缩短一点，就像磨损铁杆一样，如果磨损得只剩下一个残根时，细胞就接近衰老。细胞分裂一次其端粒的DNA丢失约30200bp(碱基对)。第三、研究发现，细胞中存在一种酶，它合成端粒。端粒的复制不能由

6、经典的DNA聚合酶催化进行，而是由一种特殊的逆转录酶端粒酶完成。正常人体细胞中检测不到端粒酶。一些良性病变细胞，体外培养的成纤维细胞中也测不到端粒酶活性。但在生殖细胞、睾丸、卵巢、胎盘及胎儿细胞中此酶为阳性。令人注目的发现是，恶性肿瘤细胞具有高活性的端粒酶，端粒酶阳性的肿瘤有卯艇癌、淋巴瘤、急性白血病、乳腺癌、结肠癌、肺癌等等。人类肿瘤中广泛地存在着较高的端粒酶耥端挝酶作为肿瘤治疗的靶点，是当前较受关注的热点之一。 其他与寿命有关的基因也在被不断地发现，它们的工作原理与端粒相似。科学家们不但希望能找到人体内所有的生命时钟，更希望找到拨慢时钟的方法。目前很多植物的端粒酶已被提取出，许多国家的研究

7、组正在从事相关课题的研究。有观点声称，即使可保护端粒在分裂中不被降解的药物被发明，其对于生命常青的意义也有待商榷，应为当一个老年人被植入年轻的端粒后，其身体是否能接受还是一个问题凭借“发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的”这一成果，揭开了人类衰老和罹患癌症等严重疾病的奥秘的三位美国科学家（美国加利福尼亚旧金山大学的伊丽莎白布莱克本(Elizabeth Blackburn)、美国巴尔的摩约翰霍普金斯医学院的卡罗尔格雷德(Carol Greider)、美国哈佛医学院的杰克绍斯塔克(Jack Szostak)。）获得2009年的诺贝尔生理学或医学奖。 相关遗传病在染色体亚端粒区存在高度同源性序列在减数

8、分裂过程中发生异常同源重组，而导致该区域发生微小的缺失、重复或染色体相互易位，称为染色体亚端粒区重组异常。该疾病患者主要表现为不同程度的智力低下、伴有生长发育迟缓和各器官、系统的畸形。目前研究发现由此机制导致的智力低下约占智力低下患者的三体综合征。图片说明：端粒就像DNA的帽子，保护DNA重要信息不丢失(图片来源：ALFRED PASIEKA/ SCIENCE PHOTO LIBRARY)端粒学说端粒学说由Olovnikov提出，认为细胞在每次分裂过程中都会由于DNA聚合酶功能障碍而不能完全复制它们的染色体，因此最后复制DNA序列可能会丢失，最终造成细胞衰老死亡。 端粒是真核生物染色体末端由许

9、多简单重复序列和相关蛋白组成的复合结构，具有维持染色体结构完整性和解决其末端复制难题的作用。端粒酶是一种逆转录酶，由RNA和蛋白质组成，是以自身RNA为模板，合成端粒重复序列，加到新合成DNA链末端。在人体内端粒酶出现在大多数的胚胎组织、生殖细胞、炎性细胞、更新组织的增生细胞以及肿瘤细胞中。正因如此，细胞每有丝分裂一次，就有一段端粒序列丢失，当端粒长度缩短到一定程度，会使细胞停止分裂，导致衰老与死亡。 大量实验说明端粒、端粒酶活性与细胞衰老及永生有着一定的联系。第一个提供衰老细胞中端粒缩短的直接证据是来自对体外培养成纤维细胞的观察，通过对不同年龄供体成纤维细胞端粒长度与年龄及有丝分裂能力的关系

10、观察到随着增龄，端粒的长度逐渐变短，有丝分裂的能力明显渐渐变弱；Hastie发现结肠端粒限制性片段的长度随供体年龄增加逐渐缩短，平均每年丢失33bp的重复序列；植物中不完整的染色体在受精作用中得以修复，而不能在已经分化的组织中修复，这在较为高等的真核生物中也证实了体细胞中端粒酶的活性受抑制；精子的端粒要比体细胞长，体细胞缺失端粒酶活性就会逐渐衰老，而生殖细胞系的端粒却可以维持其长度；转化细胞能够通过端粒酶的活性完全复制端粒以得永生。 但是许多问题用端粒学说还不能解释。体细胞端粒长度与有丝分裂能力呈正比，这一点实验已经证实了，而不同的体细胞其有丝分裂能力是不尽相同的，胃肠黏膜细胞的分裂增殖速度就

11、比较快，神经细胞分裂的速度就比较慢。曾有人就不同年龄供体角膜内皮细胞的端粒长度进行研究发现角膜内皮细胞内端粒长度长期维持在一个较高的水平，而端粒酶却不表达。另外，Kippling发现，鼠的端粒比人类长近5-10倍，寿命却比人类短的多。这些都提示体细胞端粒长度与个体的寿命及不同组织器官的预期寿命并非一致。生殖细胞的端粒酶活性长期维持较高的水平却不会象肿瘤那样无限制分裂繁殖；端粒长度由端粒酶控制，那何种因素控制端粒酶呢？生殖细胞内端粒酶活性较高，为什么体细胞中没有较高的端粒酶活性。看来端粒的长度缩短是衰老的原因还是结果尚需进一步研究。2009年，诺贝尔瑞典卡罗林斯卡医学院将诺贝尔奖生理学或医学奖授

12、予美国加利福尼亚旧金山大学的伊丽莎白布莱克本(ElizabethBlackburn)、美国巴尔的摩约翰霍普金斯医学院的卡罗尔-格雷德(CarolGreider)、美国哈佛医学院的杰克绍斯塔克(JackSzostak)以及霍华德休斯医学研究所，以表彰他们发现了端粒和端粒酶保护染色体的机理。端粒、端粒酶与肿瘤 作者：佚名时间：2007-11-22 11:17:00来源： HYPERLINK 论文天下论文网-端粒(即染色体末端)的发现已有很长的 HYPERLINK /class_free/171_1.shtml 历史，但对其结构、功能、合成及其重要意义的认识，近年来有了很大进展。本文就端粒、端粒酶的

13、研究进展以及他们与肿瘤的关系综述如下。 一、端粒 (一)端粒的结构 端粒是位于染色体3末端的一段富含G的DNA重复序列，端粒和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物，广泛存在于真核生物细胞中，具有特殊的功能。不同种类细胞的端粒重复单位不同，大多数长58bp，由这些重复单位组成的端粒，突出于其互补链1216个核苷酸内1。人类端粒由5TTAGGG3的重复单位构成，长度在515kb范围1，2。与端粒特异性结合的是端粒结合蛋白，迄今为止，只在少数生物中确定了端粒结合蛋白的结构及表达基因，然而端粒结构与功能的保守性表明，这些端粒结合蛋白的特性可能普遍适用于其他真核生物。Chong等3在人类细胞中发现了一种端粒结合

14、蛋白，但人类染色体末端的DNA-蛋白复合体的结构还不清楚。 (二)端粒的功能 端粒高度的保守性表明，端粒具有非常重要的作用。其主要功能包括： 1.保护染色体末端：真核生物的端粒DNA-蛋白复合物，如帽子一般，保护染色体末端免于被化学修饰或被核酶降解，同时可能还有防止端粒酶对端粒进行进一步延伸的作用1。改变端粒酶的模板序列将导致端粒的改变，从而诱导细胞衰老和死亡4。 2.防止染色体复制时末端丢失：细胞分裂、染色体进行半保留复制时，存在染色体末端丢失的问题5。随着细胞的不断分裂，DNA丢失过多，将导致染色体断端彼此发生融合，形成双中心染色体、环状染色体或其他不稳定形式。端粒的存在可以起到缓冲保护的

15、作用，从而防止染色体在复制过程中发生丢失或形成不稳定结构1。 3.决定细胞的寿命：染色体复制的上述特点决定了细胞分裂的次数是有限的，端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”6。 4.固定染色体位置：染色体的末端位于细胞核边缘，人类端粒DNA和核基质中的蛋白相互作用，以TTAGGG结构附着于细胞核基质(包括nuclear envelope和internal protein)3。 (三)端粒的长度 端粒的长度在不同的细胞之间存在着差异。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度大于体细胞7。体外培养细胞端粒的长度随着细胞逐代相传而缩短，每复制一代即有50200nt的DNA丢失，端粒丢失到一定程度即失

16、去对染色体的保护作用，细胞随之发生衰老和死亡。所以，通过测定端粒的长度可以预测细胞的寿命6。人体细胞端粒的长度不一，存在着个体差异，随着年龄的增长，端粒每年减少约1540 nt7，最终细胞衰老。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度不随着细胞分裂次数的增加而缩短，具有无限分裂的能力，其原因就在于端粒酶的存在7。 二、端粒酶 (一)端粒酶的结构和功能 端粒酶是由端粒酶RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，通过识别并结合于富含G的端粒末端，以自身为模板，逆转录合成端粒1。 1995年，Junli等8克隆了人类端粒酶RNA基因，在长约450个碱基的人端粒酶RNA(hTR)序列中，有一段长11个核苷酸的区域(5-C

17、UAACCCUAAC-3)，与人端粒序列(TTAGGG)n互补，发生在该模板区域的hTR突变将导致端粒酶功能的改变。 端粒酶蛋白质成分的分离十分困难，直到1995年，Greider等9才纯化并克隆了四膜虫端粒酶的两个多肽成分，即p80和p95。1997年，人们克隆并描述了两种人类端粒酶蛋白TP 1(telomerase associated protein 1)10和TP 2(telomerase associated protein 2或hTRT)1 1。其中TP 1与四膜虫端粒酶蛋白p80同源，能与端粒酶RNA特异性结合；TP 2与啤酒酵母S.cerevisiae的端粒酶蛋白Est2p同源

18、，和逆转录酶的结构相似，是端粒酶的催化亚单位，在肿瘤细胞端粒酶的激活中起关键作用12。 四膜虫端粒酶RNA及其两个多肽成分(p80, p95)是组成端粒酶的唯一必要成分，鉴于端粒酶在进化中的保守性，hTR和TP 1、TP 2是否构成了完整的人类端粒酶，目前尚无定论。 (二)端粒酶活性的调节 端粒酶的活性在不同的层次上受到各种因素的调节。 1.hTR: hTR是端粒酶的重要成分，在体外培养的HeLa细胞中转染反义端粒酶RNA，将导致端粒DNA的缩短和肿瘤细胞的死亡8。但许多研究表明，hTR的水平并不能代表端粒酶活性水平，缺乏端粒酶活性的细胞同样可以有hTR的表达。可见端粒酶RNA并不是调节端粒酶

19、活性的唯一因素13。 2.端粒酶蛋白：TP 1或TP 2基因的突变，均可导致端粒酶的失活10，11，TP 2基因在不同的细胞有不同的剪切位点，可能以此改变TP 2的生化特性，从而起重要的调节作用14。 3.癌基因与抑癌基因：癌基因和抑癌基因对肿瘤的发生、发展起着重要的作用。Wright等15根据体外培养细胞的永生化过程提出了肿瘤发生的M1/M2模型，即细胞经过有限次的分裂后进入M1期，细胞衰老走向死亡，抑癌基因p53或Rb的突变等使细胞逃脱生长控制的机理使细胞渡过M1期，再次经过若干次的分裂，进入M2期，少数细胞发生端粒酶的激活成为永生细胞，此时仍然需要p53或Rb的突变存在。有研究报道，使缺

20、乏抑癌基因p53/Rb的肿瘤表达Rb蛋白(pRb)，细胞停滞在G0/G1期并发生老化现象，抑制pRb后细胞重新开始合成DNA，但大多数细胞在分裂中死亡，p53无此现象16。另一项关于卵巢癌的研究提示，p53与端粒酶活性无关17。抑癌基因与端粒酶的关系并不明确。 4.细胞分化及细胞周期对端粒酶活性的影响：用 HYPERLINK /class_free/120_1.shtml 药物诱导的细胞分化实验表明，随着细胞分化，端粒酶活性随之降低，而抗分化的细胞则无影响18，永生细胞株端粒酶的活性在各细胞周期中无显著变化，而与细胞的生长速度相关19，使细胞脱离生长周期能否抑制端粒酶的活性，各报道不一18，1

21、9。然而，作出端粒酶活性与细胞周期无关的结论为时尚早，细胞的生长、分化与端粒酶活性调节间的关系，还有待于研究。 5.端粒的长度与端粒酶激活：当端粒缩短到一定程度后才有端粒酶的激活，其机理可能在于，缩短的端粒导致基因的不稳定，某些突变如激活端粒酶、丢失抑癌基因使细胞获得不死性，成为优势克隆。端粒的缩短成为端粒酶激活的前提20。但此理论不能解释某些肿瘤细胞中端粒较长的现象。 端粒酶活性的调节机理错综复杂、说法不一，胚胎早期端粒酶的活性随着胚胎的发育而逐渐消失(生殖细胞例外)，而细胞获得不死性及肿瘤的发生，又与端粒酶的再次激活密切相关，其机理目前还不清楚。 三、端粒、端粒酶与肿瘤 (一)端粒、端粒酶

22、与人类肿瘤的关系 正常细胞的分裂次数是有限的。端粒酶的激活是细胞走向永生化的必要途径，而永生化又被认为是肿瘤恶化的必要步骤。肿瘤细胞的端粒长度很短，其继续缩短将导致染色体融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的长度，从而维持肿瘤的继续分裂、增殖和生存21。端粒酶的表达，可能是肿瘤形成和发展的共同途径。 人类细胞端粒酶活性水平较低，以及很难获得大量的肿瘤标本，使得早期对人类端粒酶的研究受到了很大限制。1994年，Kim等22创立了测定端粒酶活性的telomere repeat amplification protocol(TRAP)法，用裂解缓冲液代替原低渗液，提高了细胞的裂解程度，并引入聚

23、合酶链反应(PCR)，使反应的灵敏性提高了104倍。至今已在大多数人类恶性肿瘤中测到了端粒 酶的活性。有些实验表明，端粒酶的活性与某些肿瘤的恶性程度和预后相关17，21。端粒酶在恶性肿瘤发展中的作用日益明晰21。 (二)端粒酶在妇科肿瘤方面的研究 大多数妇科恶性肿瘤有端粒酶的表达23。由于卵巢含生殖细胞成分，子宫内膜周期性脱落具有再生能力，使得端粒酶具有不同于一般组织的特殊性。 1.卵巢肿瘤：良性卵巢肿瘤(如生殖细胞肿瘤、乳头状囊腺瘤)、交界性肿瘤及绝经前正常卵巢可测出端粒酶活性。但在恶性卵巢癌、低分化卵巢肿瘤及有淋巴转移者，端粒酶活性显著增高。初步的研究表明，端粒酶活性与上皮性卵巢癌的发展及

24、蔓延相关17，24。腹水细胞的结果并不一致，有报道认为，端粒酶的阳性率不高23。 2.子宫内膜癌：端粒酶在子宫内膜癌中表现为强阳性，同时正常子宫内膜可以有端粒酶活性，绝经前甚至可表现为强阳性。有关研究未发现端粒酶活性与肿瘤的分期、浸润的深度及DNA的成分相关25。这与子宫内膜的周期性再生有关。 3.宫颈癌：有研究表明，端粒酶的激活发生在宫颈癌的早期，与其进展有关，有希望成为宫颈癌诊断及预后的标记物26。虽然绝大多数宫颈癌端粒酶阳性，但在正常宫颈及宫颈上皮内瘤样变中的阳性率报道不一。Zheng等26的研究结果为，宫颈脱落细胞涂片的端粒酶阳性率分别为7%及40%，而Gorham等23报道的阳性率为

25、0%。 (三) HYPERLINK /class_free/121_1.shtml 临床应用前景 1.肿瘤的治疗方面：端粒酶与恶性肿瘤之间令人惊异的相关性，使他在肿瘤的诊断和治疗上有望成为行之有效的新的靶目标。因为端粒酶主要存在于恶性肿瘤，而在大多数正常组织中没有活性或活性极低，同时由于端粒酶在恶性肿瘤的发生，尤其是在肿瘤的发展中起着关键的作用21。所以，通过各种途径抑制端粒酶的活性，可能将有效地抑制大多数肿瘤的生长，而对大多数正常细胞没有影响。这种抑制作用可以通过直接抑制端粒酶活性、抑制端粒酶RNA(如导入反义核酸)，或端粒酶蛋白成分以及诱导肿瘤细胞发生分化等方法实现。 2.诊断与鉴别诊断及

26、临床预后方面：端粒酶可以出现在某些肿瘤的早期甚至癌前病变，在分化低有转移倾向的肿瘤中高度表达，使其在诊断及评价预后方面，具有一定价值。 在人类端粒及端粒酶的基础研究中，还存在着许多问题，有待进一步研究，如人类端粒末端的精细结构，端粒的非端粒酶延伸机理；人类端粒酶的具体结构及其基因所在的位置；端粒酶的激活机理及其活性调节；端粒酶在肿瘤的发生中的作用；如何有效地抑制端粒酶活性；缺乏端粒酶活性的肿瘤的生长机理等。总之，端粒、端粒酶在肿瘤的研究中具有广阔的前景，将为人类攻克肿瘤开辟新的视野。 参考文献 1Rhyu MS. Telomeres, telomerase,and immortality. J

27、 Natl Cancer Inst, 1995,87:884-894. 2Moyzis RK, Buckingham JM, Cram LS, et al. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG) n, present at the telomeres of human chromosomes. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85:6622-6626. 3Chong L, van Strrnsel B, Broccoli D, et al. A&n bsp;human telomeric prote

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29、7 DNA. Nature New Biol, 1972,239:197-201. 6Harly CB, Futcher AB, Greider CW. Telomeres shorten during aging of human fibroblasts. Nature, 1990,345:458-460. 7Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, et al. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89:

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39、and in vivo cervical carcinogenesis. Gynecol Oncol, 1997,66:222-226. 非小细胞肺癌患者外周血TA，CEA mRNA和CK19 mRNA检测比较作者：时间：2007-11-22 11:36:00来源： HYPERLINK 论文天下论文网- 作者：庞桂芬 卢云涛 杨林瀛 杜新生 刘怀深 薛承岩 白海洋 【摘要】 目的： 探讨检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者血液中TA，CEA mRNA，CK19 mRNA的 HYPERLINK /class_free/121_1.shtml 临床意义，评价三者诊断NSCLC血液转移的应用价值. 方

40、法： NSCLC组74例，非肿瘤性呼吸系统疾病患者(疾病对照组) 51例和健康人(健康对照组) 36例，应用端粒末端重复序列扩增杂交酶联免疫检测技术检测TA，逆转录套式聚合酶链反应技术检测CEAmRNA和CK19 mRNA. 结果： NSCLC组血液TA，CEA mRNA和CK19 mRNA阳性率高于两个对照组(P0.05). 结论： 检测血液TA，CEA mRNA和CK19 mRNA有助于发现NSCLC细胞血液转移，且TA和CEA mRNA的价值高于CK19 mRNA，但此3个指标可能无助于鉴别NSCLC的类型. 【关键词】 癌 非小细胞肺 血液 端粒 末端转移 酶癌胚抗原 角蛋白 RNA

41、信使 0引言 非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌的70%以上，约50%多的NSCLC患者在最初诊断时已有远处转移，预后较差. 肺癌微转移是肺癌的恶性标志和主要特征之一，也是导致治疗失败和患者死亡的主要原因. 因此，明确肿瘤有无转移，对治疗决策的制订、预后评估等具有重要的 HYPERLINK /class_free/25_1.shtml 指导意义，早期诊断和治疗肺癌微转移是提高肺癌治疗率、改善患者预后的有效途径. 至今，对NSCLC早期转移、微转移、血行转移等的诊断仍没有令人满意的方法. 研究提示，检测血液中端粒酶活性(TA)和癌胚抗原信使核糖核酸(CEA mRNA)指标对了解NSCLC血液转移

42、有较大帮助，且作用优于CK19 mRNA. 1对象和方法 1.1对象我院住院NSCLC患者74（男47，女27）例，年龄3775岁，其中腺癌24例，鳞癌22例，腺鳞癌14例，大细胞肺癌14例. 非癌性肺部疾病患者(疾病对照组)51（男29，女22）例，年龄1676岁，包括间质性肺炎9例，支气管扩张9例，肺结核11例，肺囊肿11例，炎性假瘤11例. 均经手术或穿刺活检病理证实诊断. 健康志愿者(健康对照组)36（男20，女16）例，年龄1875岁. 对肿瘤患者及检测指标阳性者通过 HYPERLINK /class_free/147_1.shtml 通信、电话形式进行随访0.53 a. 应用柠檬酸

43、钠抗凝剂真空采血管采集静脉血液，分离、提取有核细胞，预冷生理盐水充分洗涤有核细胞，以备检测TA，CEA mRNA及CK19 mRNA. 如不能即时检测，应尽快提取血液有核细胞，分装后封存于-70. 1.2方法应用端粒末端重复序列扩增杂交酶联免疫检测技术(TRAPHybELISA)检测TA，试剂盒为华美生物工程公司商品试剂盒. 检测操作经过端粒酶催化端粒末端重复序列复制、PCR扩增、扩增产物微孔板杂交、酶联免疫测定等步骤，于450 nm波长测定各反应孔A值，以检测孔A值2.0倍阴性对照孔A值为端粒酶阳性结果. 应用逆转录套式聚合酶链反应技术(RTNPPCR)检测CEA mRNA和CK19 mRN

44、A，CEA mRNA检测试剂盒为上海复星生物技术有限公司的商品试剂盒，CK19 mRNA检测试剂盒由北京美迪科生物科技有限公司提供. 操作经RNA模板提取、逆转录合成cDNA、套式PCR扩增、扩增产物琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染色、紫外检测等步骤，以出现与试剂盒提供的阳性对照同齐的核酸电泳亮带为阳性结果. 实验按试剂盒操作说明书进行. 统计学处理：组间比较应用2检验，同组内两种检测结果比较应用配对2检验法. 2结果 2.1外周血TA，CEA mRNA 和CK19 mRNA变化在疾病对照组，2例TA阳性结果分别来自肺结核和炎性假瘤；CEA mRNA阳性结果分别为肺结核2例，炎性假瘤1例；CK19 mRNA的阳性结果为肺结核2例，炎性假瘤2例，肺囊肿2例，间质性肺炎1例. 健康对照组的2例CK19 mRNA阳性者，未见任何有意义的检查及既往发现，其中，1例于1，3，6，12 mo后的4次复查均呈阴性结果，另1例于1，3，6，12 mo后的4次复查中有1次(3 mo后)呈阳性结果，其余均阴性. NSCLC组的各结果与两个对照组比较，差别均有统计学意义(TA，CEA mRNA和CK19 mRNA，与疾病对照组比较2=44.218，42.789和8.345；与健康对照组比较2=38.834，40.348和11.925，