E-D2A XXXX产品Protein A含量测定标准操作程序0507 4

1、最新E-D2A XXXX产品Protein A含量测定标准操作程序0507 4方法摘要：Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体主要是IgG的Fc区结合。因而，将Protein A与琼脂糖凝胶以一定的方式结合，可制备用于抗体纯化的亲和填料。XXXX产品是用Protein A柱纯化；本标准操作程序使用Enzo公司产的试剂盒，采用酶联免疫吸附法ELISA确定XXXX产品中的宿主Protein A残留量。适用范围：本标准操作程序适用于纯化中和纯化后的各中控样品和产品的Protein A残留分析。职责：操作人员：严格按照此规程要求进行操作。 岗位主管：起草文件，

2、并确保操作程序的准确性、技术内容的完整性及文件的及时更新；监督操作规程是否与实际过程一致，资源是否满足要求；培训，确保此操作规程的正确实施。程序：术语解释无仪器设备移液管，200L，1000L；1200L；多通道移液器，300L；1200L；单通道移液器，100L；200L；1000L；1.5ml EP管；已包被鸡抗Protein A的抗体的微孔板条；塑料密封膜Enzo 30-0012震荡器Heidolph，型号 TITRAMAX1000；漩涡混合器XW-80A 上海精科实业Nano Photometer 核酸蛋白测定仪P330 Implen 德国高速台式离心机TGL-18B-C 上海安亭带有

3、SOFTmax PRO5.3 数据分析软件的酶标仪Moleclar Devices，THERMOmax。试剂Protein A ELISA试剂盒Enzo，Cat.#：ADI-900-057。Protein A clear Microtiter Plate:Protein A 抗体包被96微孔板80-0348Assay Buffer 13 55ml试验缓冲液80-1500Protein A Antibody 10ml黄颜色Protein A 生物素标记抗体80-0346Protein A Conjugate 10mlProtein A 链酶亲和素80-0347Protein A Standard

4、 Protein A 标准品 浓度为10，000pg/ml80-0621Wash Buffer Concentrate 100ml20 x浓缩洗液80-1287TMB Substrate 10mlTMB 底物80-0350Stop Solution 2 10ml终止液 10ml80-0377Protein A Assay Layout Sheet 1块Protein A 试剂放置板30-0100Plate Sealer 2张密封胶带30-00121X洗液：用超纯水将20X洗液稀释到1X，用量根据实际需要配制。实验程序Protein A 标准品梯度稀释：取7个1.5 ml EP管，依次标记为1、

5、2、3、7；1号EP管中参加500l Assay Buffer 13，2号到7号EP管中参加250l Assay Buffer 13；取50l 10 000 pg/ml标准品到1号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Standard 1Std 1 1000 pg/ml；吸取250l1号EP管中的液体参加到2号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Standard 2Std 2 500pg/ml；以此类推即为Standard 4Std 4 125 pg/ml；Standard 5Std 5 62.5 pg/ml；Standard 6Std 6 31.25 pg/ml；Standard

6、7Std 7 15.6 pg/ml；样品稀释：根据附件中样品稀释流程方法将样品稀释到2g/ml，即Sample 1 (Sp 1 2 g/ml)并标记为a号EP管；取3个1.5 ml EP管，依次标记为b、c、d；分别参加250l Assay Buffer 13；吸取250l Sample 1 到b号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Sample 2 (Sp 2)；吸取250l b号EP管中的液体参加到c号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Sample 3 (Sp 3 )；吸取250l c号EP管中的液体参加到d号EP管中，匀速吹打15次，将液体混匀，即为Sample 4 (Sp

7、 4 )；Protein A 标准品、样品预处理：将装有Protein A 标准品、样品的EP管放入沸水中煮浴5 min；取出样品，冷却到室温；13800 g离心4 min；加样：用100l移液枪分别吸取100l Protein A 标准品、样品上清液到已包被鸡抗Protein A的抗体的微孔板条；加样顺序分布如下列图：123456789101112AStd 1Std 1Sp2Sp2BStd 2Std 2Sp3 Sp3 CStd 3Std 3Sp4 Sp4 DStd 4Std 4EStd 5Std 5FStd 6Std 6GStd 7Std 7HSp1 Sp1 贴上密封胶布，25，500rpm

8、孵育1小时；洗板：弃去上清液，在吸水纸上倒扣96孔微孔板，轻轻拍打8次，将孔内残留的液体尽可能拍干；使用8道手动移液枪吸取300 l洗液Wash Buffer Concentrate 1X参加孔内，在震荡器Heidolph，型号 TITRAMAX1000震荡2min洗涤 ，每次洗完弃去洗液并在吸水纸上尽可能拍干残留洗液，重复洗涤操作3次；使用8道自动移液枪在每个板孔内参加100l黄颜色Protein A 生物素标记抗体；洗板：方法同4.6；使用8道自动移液枪在每个板孔内参加100 l Protein A 链酶亲和素；贴上密封胶布，25，500rpm孵育30 min；洗板：方法同4.6；使用8道

9、自动移液枪在每个板孔内参加100l TMB 底物；贴上密封胶布，25，500rpm孵育15 min；使用8道自动移液枪在每个板孔内参加终止液；用酶标仪在450nm下读取OD值；数据分析及报告根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的线性回归方程；根据倍比稀释样品的OD值在回归方程上计算出对应的Protein A浓度；根据稀释系数进行校正，算出样品的Protein A浓度；记录15.61000pg/ml范围内的分析数据； 从样品送检人处获得产品浓度；按照下式计算产品中Protein A的含量(ppm)Protein A含量ppm=Protein A浓度pg/ml产品ug/ml记录Protein A含量ppm单个值和平均值，保存小数点后2位；同时记录变异系数CV，并保存小数点后1位。系统适应性标准曲线的相关系数r2应0.990；样品量应在可检测范围内；变异系数CV应由至少2次有效稀释在检测限内测定结果的平均值计算所得，该变异系数CV应25%。；假设变异系数CV25%，且样品经屡次稀释2次或仅仅2次稀释均在检测限内，落点将开始于最低稀释浓度并向最高稀释浓度延伸直至CV25%。系统适应性的接受标准为以上工程均符合要求。实验完成后及时填写记录