生物化学第六章酶化学

1、生物化学第六章酶化学第一节概述一、酶的概念1、酶的概念-酶是生物催化剂（1）所有酶均由生物体产生几乎所有的生物都能合成酶，甚至病毒也能合成或含有某些酶。（2）酶和生命活动密切相关几乎所有的生命活动或过程都有酶参加A执行具体的生理机制，如乙酰胆碱酯酶和神经冲动有关。B参与消除药物毒物转化的过程，如限制性核酸内切酶能特异性地水解外源DNA,防止异种生物遗传物质的侵入。C协同激素等物质起信号转化、传递与放大作用，如细胞膜上的腺苷酸环化酶。D催化代谢反应，在生物体内建立各种代谢途径，形成相应的代谢体系。酶的组成和分布是生物进化与组织功能分化的基础。不同生物，有各自相应的酶系和辅酶；即使同类生物，酶的组

2、成与分布也有明显的种属差异,例如精氨酸酶只在排尿素动物的肝脏内，在排尿酸的动物中没有；例如，肝脏是氨基酸代谢与尿素形成的主要场所，因此，精氨酸酶几乎全部集中在肝脏内。在生物的长期进化过程中，为适应各种生理机能的需要，为适应外界条件的千变万化，还形成了从酶的合成到酶的结构和活性各种水平的调节机制。2、酶的化学本质-大多数酶都是蛋白质（1）酶的相对分子质量很大,如胃蛋白酶的相对分子质量为36000.（2）酶由氨基酸组成，将酶制剂水解后可得到氨基酸。（3）酶具有两性性质（4）酶的变性失活与水解一切可以使蛋白质失活变性的因素同样可以使酶变性。酶都是蛋白质？核酶不是二、酶的催化特性1、高效率酶的催化效率

3、比一般化学剂高1061013倍2、专一性一种酶只能作用于一类或某一种物质的性质称为酶作用的专一性或特异性。蔗糖酶只能催化蔗糖等。三、酶的组成及分类1、酶的组成根据组成分为单纯酶和结合酶单纯酶：由简单蛋白质构成，如水解酶（淀粉酶、蛋白酶等）结合酶：结构中含有蛋白质和非蛋白成分，结合酶分为酶蛋白或脱辅基酶蛋白，非蛋白成分称为辅因子，辅因子又分为辅酶（与酶蛋白结合疏松，可用透析法除去）和辅基（不能用透析法去除）两类。辅酶及辅基从化学本质来看分为两类：一类为无机金属元素（铜/锌/镁/锰等），另一类为小分子有机物，如维生素。酶蛋白决定酶的专一性。2、酶的命名3、酶的分类酶按其催化的反应分类氧化还原酶类这

4、类酶催化氧化还原反应，如脱氢酶、氧化酶、还原酶。转移酶类催化基团转移反应，大多数需要辅酶参与水解酶类催化加水分解反应裂合酶类催化从底物上移去基团形成双键异构酶类催化单底物单产物的反应，催化底物结构的异构化反应。合成酶类催化两个底物分子反应生成一个分子，大多数需要提供能量才能进行。第二节酶的结构与功能的关系一、酶的一级结构与催化功能的关系1、必需基团-酶分子中只有少数几个氨基酸侧链基团与活性直接相关定义：关系到酶催化作用的化学基团称为酶的必需基团。常见的有组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基等。必需基团分为两类：能与底物结合的必需基团称为结合基团；能促进底物发生化学变化的必需基团为催化基

5、团。2、酶原激活-切去部分片段是酶原激活的共性有些酶原的激活过程是通过去掉分子中的部分肽段，引起酶分子空间结构的变化从而形成或暴露出活性中心。如凝血过程中酶原的激活过程。另外一些酶当其肽链在细胞内合成之后，即可自发盘曲折叠成一定的三维结构，立即表现出全部酶活性。3、共价修饰-改变一定基团可使酶活性改变应用化学试剂可与某些氨基酸侧链基团发生结合、氧化或还原等反应，生成共价修饰物，使酶分子的一些基团发生结构和性质的变化。不同氨基酸侧链基团可用不同的修饰剂，同一侧链基团可用几种修饰剂来修饰。酶共价修饰的基本要求：（1）修饰剂的要求相对分子质量小、对蛋白质吸附有良好的生物相容性和水溶性、表面有较多的反

6、应活性基团、修饰剂上反应基团的活化方法和活化条件以及修饰后酶科学研究的半衰期越长越好。（2）酶的要求熟悉酶反应的最适条件和稳定性条件，酶的活性部位的情况以及酶分子侧链基的化学性质以及反应的活性等。（3）反应条件的确定选择的条件尽可能少的破坏酶活性必需基团，一般二硫键的断裂将使酶变性而丧失其催化功能。二、酶的活性与其高级结构的关系1、活性中心-酶分子中只有很小的结构域与活性直接相关活性中心：通常把酶分子上必需基团比较集中并构成一定空间构象、与酶的活性直接相关的结构区域称为酶的活性中心。活性中心包括结合中心和催化中心。2、牛胰核糖核酸酶拆合实验二级结构、三级结构与酶活性的关系以枯草杆菌蛋白酶水解R

7、Nase分子中的Ala20-Ser21间的肽键产生的影响为例图6-1旳12丙11024$蛋臼图卜1牛胰楂糖核期醜分子的切断与去纠I枯草杆繭S肽与S蛋白单独存在时没有活性，但将两者按1:1的比例混合，则能恢复酶活性，虽然第20位与第21位之间的肽键并未恢复。这是因为S肽通过氢键及疏水作用与S蛋白结合，使His12和His119在空间位置上互相靠近而重新形成了活性中心。可见，只要酶分子保持一定的空间构象，使活性中心必需基团的相对位置保持恒定，一级结构中个别肽键的断裂，甚至某些区域的小片段的去处并不影响酶的活性。3、聚合与解聚四级结构与酶活性的关系具有四级结构的酶，按其功能分为两类：一类与催化作用有

8、关，另一类与代谢密切相关。四级结构完整时，酶的催化功能才会充分发挥出来，当四级结构被破坏时，亚基被分离，若采用的分离方法适当，被分离的亚基仍保留着各自的催化功能，但用强烈的条件破坏其四级结构形成的亚基则没有催化功能，如天冬氨酸转氨甲酰酶4、同工酶-高级结构与酶活性关系的典型（1）同工酶的概念指的是能催化相同的反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成不同的一组酶。（2）同工酶的结构与功能同工酶的结构主要表现在非活性中心部分不同或所含亚基组合情况不同。乳酸脱氢酶（LDH）二二LDH)LDHj二二LDH!.DH4阴械LDHf肾讪LHt-2乳醴脱氢酷同丄酣电泳图谓四眾棒殒白*有五种同工爾这五种同丁.誨的犯基

9、组成不間;Tcra8仙urn.SCTffLDHnapamLDH，u戸0&牡0LDik说明：同一种组织或同一细胞中所含的同一种酶可在结构上显示出器官特异性或细胞部位特异性。LDH有5种同工酶，LDH1主要分布在心肌中，LDH5主要分布在骨骼肌中。（3）研究同工酶的意义同工酶具有组织器官特异性和细胞部位特异性，在体内调节上具有重要意义。同工酶的研究为细胞分化、发育、遗传等方面提供了分子基础。（相对比例发生变化）同工酶分析法在农业上开始用于优势杂交组合的预测在临床上可用同工酶作某些病变的诊断指标，如骨骼肌损伤、急性肝炎及肝癌患者LDH5增高。第三节酶催化反应的机制一、酶促反应的本质1、酶是催化剂只影

10、响反应速率而不改变反应平衡点能加速化学反应速率只能加速在热力学上有可能进行的化学反应只能缩短化学反应达到平衡所需要的时间,不改变化学反应的平衡点催化可逆反应的酶对可逆反应的正反应和逆反应都有催化作用。2、加速反应的本质降低活化能A+-B翩.反应过程ABf产物.Si有載谡比反l应的活化能3、中间产物学说-酶的工作方式学说认为在酶促反应中，底物先与酶结合成不稳定的中间产物，然后再分解释放出酶与产物。解释：当底物和酶结合成过渡态的中间物时，要释放一部分结合能，这部分能量的释放，使得过渡态的中间物处于比E+S更低的能级，因此使整个反应的活化能降低，使反应大大加速。中间产物可以被证明存在，如有些可以直接

11、用电镜观察或X射线衍射而证实其存在。二、酶反应机制1、酶作用专一性的机制-诱导契合学说屁酣仝催疋SE团图卜4诱泵契脅学说吞建图诱导契合学说认为（1）酶分子具有一定的柔顺性（2）酶的作用专一性不仅取决于酶与底物的结合，也取决于酶的催化基团有正确的取位。2、酶作用高效性的机制-共价催化与酸碱催化共价催化是指：亲核催化剂或亲电子催化剂分别放出电子或吸收电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间配合物，这个中间物很容易变成转变态，因此，反应活化能大大降低，底物可以越过较低的能阈而形成产物。酸碱催化：是通过瞬时地向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态、加速反应的一种催化机制

12、。有两种酸碱催化剂，狭义的酸碱催化剂，即H离子和OH离子和广义酸碱催化剂，即质子供体和质子受体。第四节酶促反应动力学一、酶促反应的基本动力学1、底物浓度的影响-底物浓度对酶促反应速率的影响是非线性的一聂反磧琵昔圾反应零艰巫应J图专-E幽促反应邃率与低物傩度的关系2、米氏方程定量表达底物浓度与酶反应速率的关系米氏方程：(P112)Km：米氏常数为酶促反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度3、Vmax和Km-动力学基本参数(1)Km值的求法利用v-Cs图求，斜牢=图6-8EadiHofsl址和IIelfcs（i）匕ulie-HcM蛀怦图itb）丹旳辟朴图iofsiet和H呛嘲柞團为动力学研究者所

13、偏爱，怛双倒数作團法那Eadie-Hofstee和Hanes作图2）米氏常数是酶学研究中的重要数据Km是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关。Km的应用是有条件的（在一定的温度、pH值等条件下）Km值可以反映酶同底物的亲和力如果一个酶对某底物的Km值越大，说明反应速率达到最大反应速率一半的时候所需底物浓度高，表明酶同底物的亲和力小。底3X105X10-L.It6-5-燮醋的米氏常融己斷議酶己晡議釉Ke.U脸離乳*白聘碰乳东白初过籾化竜擁Jtt珀浪睨魚叫曲附战脫氧劇卑轉脱曲岛-笨用战酪氨战胺I0T35Xl&-t6X10-.&xio-3LSX10-*ISHI酸推HcnrL2X1013.2

14、X10-h?XSXlfl-13）酶的Km值在实际应用中的重要意义鉴定酶通过测定Km值，可鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。判断酶的最适底物一种酶可能作用于多个底物，就有多个Km值，Km值最小的就是最适底物。计算一定速率下的底物浓度了解酶的底物在体内具有的浓度水平判断反应方向或趋势（正逆两向的Km值常常不同）判断抑制类型测定不同抑制剂对某个酶的Km及Vmax的影响，可以判断该抑制剂作用类型。推测代谢途径，一种物质在体内有不同的代谢途径，根据Km判断催化的不同途径。如丙酮酸的转化方向判断。二、酶浓度对酶反应速率的影响TOC o 1-5 h z酶

15、耀度I图6-10酶就度对酶j反应逮率的影响_7.帕咅具门ftmcr.cfri&Fia7i当底物浓度大于酶浓度条件下，pH、温度一定时，反应速度与酶浓度成正比三、温度对酶反应速率的影响温度每升高10度所增加的反应速率称为温度系数（Q）。一般化学反应的Q1010为2-3（提高2-3倍）。同一种酶最适宜的温度不是一定的，跟底物浓度、激活剂、抑制剂等因素有关。四、pH值对酶反应速率的影响烹霍4爪躍掘匡（1）酶反应具有各自的最适pH值，并且最适pH往往与等电点不一致。（2）经过部分修饰的酶，其最适pH通常不变（3）最适pH值主要和活性中心侧链基团的解离直接相关，并不是作用于整个酶分子，而是改变了酶活性中

16、心或与之相关的基团的解离状态。五、激活剂对酶反应速率的影响激活剂或活化剂：凡能提高酶的活性，加速酶促反应进行的物质称为激活剂或活化剂。酶的激活与酶原的激活不同，酶激活是使已具有活性的酶的活性加强，使活性变大；酶原激活是使本来无活性的酶原变成有活性的酶。有些酶的激活剂是金属离子或某些阴离子，如许多激酶需要Mg2+。激活剂的作用是相对的，一种酶的激活剂对另一种酶来说，也可能是一种抑制剂。不同浓度的激活剂对酶活性的影响也不同。六、抑制剂对酶反应速率的影响1、抑制所用的概念-抑制作用不同于失活作用和去激活作用（1）失活作用：指酶蛋白分子受到一些物理或化学因素的影响后次级键被破坏，部分或全部改变了酶分子

17、的空间构象，从而引起酶活性的降低或丧失，这是酶蛋白变性的结果。（2）抑制作用：指酶的必需基团（包括辅因子）的性质受到某种化学性质的影响而发生改变，导致酶活性的降低或丧失。这时酶蛋白一般并未变性。（3）去激活作用：某些酶只有在金属离子存在下才能很好的表现其活性，如果用金属螯合剂去除金属离子，会引起酶活性的降低或丧失。2、抑制作用的类型可逆抑制与不可逆抑制（1）不可逆抑制：这类抑制作用通常指抑制剂与酶活性中心必需基团以共价键结合，引起酶活性丧失，包括非专一不可逆抑制和专一性不可逆抑制。（2）可逆抑制：这类抑制作用是指抑制剂与酶蛋白以非共价键结合，具有可逆性，可用透析、超滤、凝胶过滤等方法将抑制剂除

18、去。竞争性抑制：某些抑制剂的化学结构与底物相似，因而与底物竞争性地同酶活性中心结合，当抑制剂与活性中心结合后，底物就不能再与活性中心结合，反之，如果酶活性中心已被底物占据，则抑制剂也不能同酶结合，所以，这种抑制作用的强弱取决于抑制剂与底物浓度的比例。这种抑制可以通过增大底物浓度的方法来消除。非竞争性抑制：酶可以同时与底物及抑制剂结合，两者没有竞争作用。不能用增大底物浓度的方法来消除抑制作用。非竞争性通常与酶的非活性中心部位结合，这种结合引起酶分子构象变化，致使活性中心的催化作用降低。非竞争性抑制作用的强弱取决于抑制剂的绝对浓度，因而不能用增大底物浓度的方法来消除抑制作用。第五节酶的制备一、酶的

19、制备及纯化1、制备战略-活性蛋白提取的一般原则应尽量低温下操作；大多数酶在pH小于4或大于10时不稳定，避免过酸过碱；酶容易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量避免泡沫形成；重金属、有机溶剂、微生物污染以及蛋白质存在能使酶失活。包括抽提、纯化和制剂制备第一步是将酶从原料中抽提出来制成酶溶液；然后纯化，即选择性地将酶从溶液中分离出来或者选择性地从酶溶液中移除，最后制剂制备，即将纯化的酶做成一定形式的制剂。2、酶提取纯化的方法-不同目的选用不同的方法（1）预处理和破碎细胞（植物、动物、现多为微生物材料）胞外酶不用细胞破碎，胞内酶需要；动植物用绞肉制成组织糜、或高速研磨；微生物材料用丙酮

20、，能有效破坏细胞壁、同时溶解脂肪，溶菌酶和盐振荡方法等。（2）抽提（考虑的因素，pH、盐、温度、其他）过酸过碱不可；低浓度盐溶液中溶解度较大，一般用等渗溶液；温度一般控制在0-4度（3）浓缩：蒸发、超过滤、凝胶过滤、冰冻浓缩、其他蒸发（真空条件下好）；超过滤（允许小分子和水分子通过微孔超滤膜，没有热破坏）；凝胶过滤（利用葡聚糖凝胶Sephadex能吸水膨润、而酶分子排阻于凝胶外的原理进行的）；冰冻浓缩（原理：溶液相对于纯水熔点升高，冰点降低）（4）酶的纯化（纯化的含义、纯化方法的选择）纯化方法：根据溶解度（盐析法、有机溶剂沉淀法等）根据分子大小（凝胶过滤，超过滤和离心）；解离电学性质（离子交换

21、色谱法）；利用稳定性差异（如选择热变性法、碱变性法等）；基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和性作用的特点，如亲和色谱法。二、酶活性的测定1、定性测定-根据酶催化的反应判断检查某一个酶是否存在，利用该酶所催化的化学反应特征，将所提取的酶液与它所催化的底物在一定条件下进行反应，如有产物产生，并且一经煮沸此种活性即消失，就可以证明提取液中有此酶的存在。2、活力单位表示酶量的指标酶活力：酶催化一定化学反应的能力称为酶活力。酶活力单位：表示酶活力大小的单位，是根据某种酶在最适条件下，单位时间内酶作用的底物的减少量或产物的生成量来表示，所以，反应速率的单位为：浓度/单位时间3、比活力-表示酶纯

22、度的指标比活力：是指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数（有时也用每克酶制剂或每毫升制剂含多少活力单位来表示）。即比活力=活力单位数/毫克酶蛋白（氮）4、转换数-另一种表示酶催化能力大小的方法酶的转换数表示酶的催化中心的活性，它是每秒内每一催化中心（或活性中心）所能转换的底物分子数，或每微摩尔酶活性中心每秒转换底物的物质的量。5、酶活力的定量测定方法-不同酶选用不同方法（1）化学分析法：根据酶的最适温度和最适pH,从加进酶液后即开始反应，每隔一定时间，分几次取出一定容积的反应液，停止作用，然后分析底物的消耗量和产物的生成量。（2）分光光度计量法利用底物和产物光吸收性质的不同，在整个反应过程中可不断的

23、测定其吸收光谱的变化。（3）量气法当酶促反应中底物或产物之一为气体时，可以测定反应系统中气相或压力的改变（4）pH值测量法使酶反应在较稀的缓冲液中进行，然后用pH计测定反应进行过程中溶液的pH的改变。（5）氧和过氧化氢的极谱测定：用阴极极化的铂电极进行氧的极谱测定，可以记录在氧化酶作用过程中溶解于溶液内的氧浓度的降低。第六节酶的多样性一、核酶和蛋白质的自我剪接核酶能催化RNA分子中一定部位的磷酸二酯键，DNA、直链淀粉的分支反应。二、调节酶调节酶：这种在体内活性可发生改变并调节代谢速度的酶，称为调节酶。通过酶分子本身的结构变化来改变酶的活性。1、共价修饰酶共价修饰或化学修饰：酶蛋白分子肽链上某

24、些氨基酸基团，在另一种酶的催化下，发生可逆的化学修饰，使酶分子共价连接（或脱掉）一定的化学基团，称为共价修饰或化学修饰。2、别构酶变构酶：不是通过共价键的变化（化学基团），而是通过酶分子构象的变化来改变酶的活性。别构酶具有两个空间上彼此独立并分开的特异部位，即活性部位和调节部位。前者是底物结合部位，后者为效应物（或调节物，常常为代谢产物）的结合部位。当底物与活性部位结合时，酶即催化底物转变为产物；当效应物同调节部位结合时，可引起酶分子的构想变化，从而引起酶活性的改变。3、聚合解聚调节酶这类调节酶中，有的是亚基聚合后才有活性，有的则相反，解聚后才是有活性的，聚合后是无活性的（或活性降低）。三、多

25、功能酶多功能酶是指结构上仅为一条肽链，却具有两种或两种以上功能的酶蛋白。四、人工酶1、抗体酶抗体酶是将抗体（免疫球蛋白）的高度选择性（专一性）与酶的高效催化能力融为一体的特殊蛋白质，它既具有酶的催化特性，又能与特异性抗原相结合。人工合成的半抗原免疫动物，使该动物产生抗体，这种抗体即具有酶的催化功能和抗体专一性。2、突变酶利用蛋白质工程技术将天然酶的活性基团进行改造所得到的酶称为突变酶。3、模拟酶利用有机化学的方法合成比酶分子结构简单得多的具有催化功能的非组蛋白，这种分子模拟天然酶对底物结合和催化过程，既具有酶催化作用的高效率和专一性又具有比天然酶稳定的特性。模拟分为3个层次：（1）合成具有类似酶活力的简单化合物（2）酶活性部位模拟（3）整个酶分子模拟第七节酶在工业上的应用及酶工程一、酶在食品工业中的应用1、淀粉加工常用的淀粉加工的酶由a-淀粉酶、0-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶和脱