中和试验检测方法

1、实验六 血清中和试验一、实验目的 了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。二、原理 抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使后者丧失感染能力。三、用途1、疾病诊断2、病毒分离株的鉴定3、不同病毒株的抗原关系研究4、疫苗免疫原性的评价5、免疫血清的质量评价6、测定实验动物血清中是否存在抗体四、材料 1、长满单层的细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）6、待检血清、阴性对照血清五、方法1、固定病毒稀释血清法 将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID50、EID50或LD

2、50）混合感作一定时间以后，接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。 以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD50）操作步骤：测定病毒液的TCID50将测好TCID50的病毒液稀释成200个TCID50的病毒悬液。在96孔微量培养板中将血清（预先56灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50l生长液，再加50l待检血清，混匀后，吸50l至下一孔，如此下去。一直到1:256），每个稀释度作4孔。在上述各孔内加入50l稀释好的病毒液，混匀

3、后放入37 5%CO2培养箱中作用45min-60min。 同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照要作 200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID50 4个不同浓度的对照。感作完成后每孔加入100l细胞悬液，放37 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。 结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。血清稀 CPE 无CPE 累计 保护率%释度 孔数 孔数 CPE孔数 无CPE孔数 1:2（10-0.3） 0 4 0 15 100(15/15)1:4（10-0.6） 0 4 0 1

4、1 100(11/11) 1:8（10-0.9） 1 3 1 7 87.5(7/8)1:16（10-1.2） 1 3 2 4 66.7(4/6)1:32（10-1.5） 3 1 5 1 16.7(1/6)1:64（10-1.8） 4 0 9 0 0(0/9)1:128（10-2.1） 4 0 13 0 0(0/13)距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/ （高于50%的保护率低于50%的保护率） =（66.7-50）/（66.7-16.7） = 0.33lgPD50=高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比例稀释度对数的差=-1.2+0.33(-0.3)=-1.299 PD50=-1.

5、299的反对数=0.05=1/20 即1:20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE2、固定血清稀释病毒法 在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。操作步骤：将病毒作连续10倍稀释将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50l，做两块板子。在其中一块板子的每孔加入50l待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入50l正常血清（对照组），混合后置37 5%CO2培养箱作用1h。然后在每孔中加入100l细胞悬液。设两纵排正常细胞对照。置37 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数中和指数=试验组TCID50 /对照组T