乳铁蛋白及其生物学功能

1、乳铁蛋白及其生物学功能浙江大学饲料科学研究所 齐莉莉 许梓荣1乳铁蛋白的来源与分布 乳铁蛋白（lactoferrin，简称LF）是一种铁结合性糖蛋白，1960年首先由Groves从牛乳中分离获得。各种哺乳动物都能产生LF，但其浓度因物种而异。人乳中含量特别丰富，初乳中高达7 gL，常乳中为l g/L。在缺铁母体中 LF浓度正常，而在蛋白质营养不良的母体中，LF浓度降低。牛乳中 LF含量要比人少得多，初乳中为 1 gL，随着泌乳的进行，浓度迅速下降。山羊、马、猪、小鼠和天竺鼠乳中LF的浓度也很低，如猪的变化范围是12 gL（初乳）03 gL（常乳）。 LF是一种分泌性蛋白质，它不仅合成于乳腺，在

2、浸润粘膜表面的多数主要分泌液中都可检测到这种蛋白，如唾液、泪液、精液、气管和鼻腔分泌物以及胰液等。LF在猪肠道中的表达部位主要在上段，从十二指肠、空肠到回肠其分泌逐渐降低。血液中的LF来自成熟的中性粒细胞的次级颗粒，一般浓度较低（约20 nmolL），这是因为肝脏能快速清除循环系统中的LF，例如人体每天要清除掉 1525 mg LF。2 乳铁蛋白的分子结构 人和牛LF的一级结构已经确定，是一条多肽链，分子量为 7080 kDa，二者氨基酸顺序同源性高达69。它们的Th级结构以螺旋和结构为主（7 以上），二者沿蛋白质的氨基酸顺序交替排列，而且螺旋大大多于结构。LF上结合有两条糖链，含量为7左右，

3、其组成包括有半乳糖、甘露糖、N一乙酰半乳糖胺、岩藻糖以及唾液酸等。 LF的立体结构是在二级结构的基础上折叠成两个基本相等的叶（N一叶和C一叶），每个叶再进一步形成两个结构域和一条裂隙。裂隙是铁结合部位，所以每个LF分子可结合两分子 Fe3+和两分子CO32-（也有文献报道为HCO3-）。在每个铁结合部位中，由4个氨基酸残基（两个酪氨酸、一个天冬氨酸和一个组氨酸）组成配位体螫合一分子Fe3+，这样的裂隙结构使LF可以非常牢固地结合铁，其结合常数高达 1020M。 CO32-连接精氨酸和Fe3+，估计有稳定铁结合的作用。此外，X射线分析发现，Fe3+结合到 LF后引起后者的构象发生变化，即铁进入敞

4、开的裂隙内部后，两结构域相应闭合，使LF的分子结构更加紧密。LF的这种构象变化，解释了铁饱和的LF（FeLF）比脱铁LF（ApoLF）更不易于变性和水解的原因。3 乳铁蛋白的主要生物学功能 近十几年来，人们对LF的生物学功能进行了广泛的研究，LF可以与许多物质以弱键和可逆的方式结合，包括金属离子、蛋白质、细胞以及DNA。LF的这种广泛的结合能力可能是其多样化生物学功能的基础。3l 促进铁吸收 LF可提高肠细胞对铁的生物可利用性，其依据之一就是人乳中铁的生物利用率要远远高于牛乳或是婴儿配方食品中铁的生物利用率。给贫血的小鼠饲喂FeLF或FeSO4，要达到同样的治疗效果，后者的摄入量需是前者的4倍

5、（分别为 50g和200 g铁）（Kawakami，1988）。姜冬梅等（1999）的试验也得出类似结果，进一步证明FeLF中的铁比FeSO4更易吸收。 转铁蛋白和LF是体内运送铁的主要蛋白质。前者主要在血液中将铁运送到合成各种含铁蛋白质的地方，而LF主要在肠道中运送铁，因此对于哺乳动物从肠道中吸收铁起重要作用。LF与铁的亲和力是转铁蛋白的250300倍，而且能在较广的范围内、pH仅22的情况下，不受损地载铁通过胃。当LF到达肠道后，即和细胞表面的LF受体（LFR）起反应，然后LFR进入细胞内部，释放出Fe3+。细胞对铁的吸收有负反馈调节机制，当胞内缺铁时细胞表面的LFR增多，增加LF与其受体

6、的结合（Mikogami，1995）。如果在摄入铁时结合使用LF不仅可以降低有效铁的使用量，而且LF螫合铁以后避免了游离铁对肠道的直接刺激作用。32 抗菌作用 在LF的诸多生物学功能当中，其抗菌活性最引人注目，该活性有两种机制：321 抑菌作用 除乳酸杆菌外几乎所有的细菌都需要铁来维持生长，ApoLF通过与需铁细菌争夺可利用铁而起到抑菌作用。母乳喂养的婴儿和哺乳仔畜肠道中需铁细菌减少，使乳酸杆菌能在其中集群，进而引起肠道pH下降，由此阻止了大肠杆菌的生长，减少传染性胃肠炎的发生率。LF的抑菌效果受多种因素影响。LF的铁含量对抑菌作用起决定作用，当LF被铁饱和后，其抑菌特性就会消失；碳酸盐可明显

7、增强LF的抑菌能力，而柠檬酸盐会减弱其抑菌效果；LF的抑菌效果与pH密切相关，pH74时效果明显优于pH 68，pH 6时基本无抑菌作用； LF对溶菌酶的活性有协同作用，溶菌酶首先对细菌胞壁进行溶解，LF使胞壁溶解完全或不完全的细菌粘连在一起而产生协同抑菌作用；与LF结合的抗体（如SIgA）亦可促进LF的抑菌作用。322 灭菌作用 LF还可直接与细菌细胞壁结合造成胞壁损伤，该作用可能和其与钙、镁的结合有关，或者是LF导致释放G-菌外层膜中的脂多糖而改变了渗透性的结果（Ellison等，1990）。LF灭菌作用的基础可能是该蛋白与微生物细胞的结合功能。研究发现，某些细菌可以表达具有LFR作用的外

8、膜蛋白质，使LF结合在细菌的胞膜上。LF的灭菌区不同于铁结合区，现已被确定和纯化，并把含有该灭菌区的肽片断命名为乳铁多肽素（Lactoferricin，简称Lfcin）。体外用猪胃蛋白酶分别水解人、牛、猪的LF，可获得相应的Lfcin。Lfcin都有1个由二硫键形成的环状物，该环状物由18个氨基酸组成，即人Lfcin由LF残基20到37构成，牛Lfcin由残基19 到 36构成。Lfcin具有比LF更强烈和更广谱的灭菌活性。例如牛Lfcin对大肠杆菌O111或金黄色葡萄球菌的最低抑制浓度是LF的十分之一。已报道的牛Lfcin抗菌范围包括许多G+和G-病原菌，例如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、绿脓杆菌

9、、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等。然而Lfcin不作用于双歧杆菌等对人体有益的细菌。此外，还发现牛Lfcin具有灭真菌作用，可以直接与其细胞结合，以致命的方式杀死白色假丝酵母和丝状真菌。为了验证LF对肠道菌丛的影响，用含有052LF的牛乳饲养小白鼠，结果发现小白鼠消化道中的大肠杆菌繁殖受到抑制，这种肠道内的抑菌作用，抑制了肠道细菌向脏器的侵入。用添加LF调制奶粉哺育婴儿，其粪便中双歧杆菌明显增多，粪便的pH降低，溶菌酶活性和有机酸含量呈上升趋势。33 免疫调节活性 LF通过抑制巨噬细胞产生集落刺激因子（CSF）而抑制粒-单系祖细胞，这种抑制作用与分子中的铁饱和程度有关，铁完全饱和的LF抑制作用

10、最强。实验观察到，LF浓度为10-16mol/L就有抑制粒-单系祖细胞生长的活性。Apo-LF的抑制活力大为减低。细菌脂多糖、锂盐、类固醇性激素都可拮抗LF对粒-单系祖细胞的抑制作用，当这些物质存在时，LF抑制巨噬细胞释放CSF的能力明显降低。LF对抗体生成、T细胞成熟、NK细胞活性、某些细胞因子生成及前列腺素生成等都有调节作用。如可促进中性粒细胞或巨噬细胞的吞噬作用和灭菌作用，对NK细胞的活化和淋巴细胞、中性粒细胞的增殖具有调节作用，但其确切机制有待研究。34 抗感染活性 LF在炎症中的作用在许多试验中都已得到证实。在机体受到感染时，吞噬细胞受到刺激合成并释放大量IL-l，在IL-1的作用下

11、，中性粒细胞释放 LF并与 Fe3+结合，结合铁的LF再被巨噬细胞所获取，造成血铁过低，血铁降低使致病菌生长繁殖受到抑制。Lima（1986）发现，LF可增强单核细胞对微生物的吞噬和对胞内寄生菌的杀伤作用。LF虽木能增强中性粒细胞对微生物的吞噬作用，但可通过两条不同的作用机制增强其胞内灭菌活性：l）ApoLF可通过对铁离子的结合，抑制被吞噬细菌在脑内生长，从而促进中性粒细胞对细菌的杀伤；2）在胞内吞噬溶酶体中的酸性环境条件下，螫合铁离子的LF可通过提供游离铁离子催化自由基生成的方式，对吞噬溶酶体内的微生物产生杀伤作用。此外，LF还具有促进多形核白细胞粘附的作用，它能使多形核白细胞粘附于血管内皮

12、细胞，从而有利于白细胞对血管外炎症部位的渗出。所以，有人把LF视为抗炎症因子。35 抗氧化功能 较早以前就有人报道，在pH值为74的NaCl溶液中，饱和度为20的LF抑制了牛脑磷脂脂质体的抗坏血酸铁盐催化的磷脂过氧化反应。LF还降低吞噬细胞OH产生的可能，从而抑制了单核细胞膜的铁催化自动氧化反应。因此，可认为LF的抗氧化机制主要是螫合了易引起氧化的铁离子。 游离的Fe3+常常参与自由基反应，将O2-氧化为O2和 Fe2+，Fe2+又将 H2O2还原为OH、OH-和 Fe3+，最终完成了由 O2-和 H2O2生成 OH、O2和OH-的反应。中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞等是通过O2-将侵入机体的

13、病原菌杀死的，而聚集在炎症或受感染部位的 Fe3+和 Fe2+会催化上述自由基反应，导致机体出现过多的氧自由基。但当游离铁结合在LF上，就不容易参与自由基反应了。4 乳铁蛋白的制备 人们自1960年以来就尝试采用各种方法制备LF，例如采用色谱法、超滤法、盐析法以及酸沉淀法等从人或牛乳中分离纯化LF。其中，超滤法是日本学者岛崎敬一提出的分离LF的新方法，操作简便，费用低廉，易形成工业化规模生产，是生产食品用LF最具实现工业化生产的方法之一。目前，随着分离精制技术不断完善，已在工业规模上开发成功从干酪乳清和脱脂乳中制备纯度高达95以上的LF，其生产技术要点是组合使用膜技术和色谱分离技术。 由于LF

14、的天然来源有限，所以大规模的工业化生产将依赖于基因工程。Liang等（1993）报道了人LF在啤酒酵母中的表达，通过将克隆的cDNA置于酵母螫合素启动子的调控下，人LF成功地在酵母细胞中合成，然后通过酵母转化酶分泌信号序列将重组人LF分泌至细胞外，产率为1520 mg/L。米曲霉是公认安全类细菌，饲料工业中使用的很多酶就是用这种菌生产的。按细胞外蛋白质的产量来说，米曲霉是最高产的。Conneely（1992）介绍了采用生物技术用曲霉菌生产LF的基本原理。Ward等（1992）把合成LF的遗传信息转移到曲霉菌中，然后在适宜条件下进行培养，从而实现了LF的优化生产，这是通过发酵大量生产LF的重大突破。美国Genpharm公司通过转基因动物来生产LF。1990年他们采用新的试管法，在荷兰生产了世界上第1头雄性转基因乳牛，并希望通过人工繁殖生产大量携带产生人LF基因的乳牛，以实现LF的大量生产。5 乳铁蛋白的应用前景 基于LF广泛的生物学功能，其应用前景非常广阔。LF及其多肽衍生物可用作高效补铁剂、防腐剂、抗氧化剂、抗真菌剂、免疫促进剂、抗肿瘤剂等。早在1988年，