动物免疫学实验技术-免疫印迹技术

1、PAGE PAGE 3 第十七章 免疫印记技术(Western-blotting technique)概 述（一）原理Western-blotting印记是将蛋白质经分离后从凝胶转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。材料和方法(一) 材料1 质粒 pW425t+SO72. 宿主菌菌株 E.coli X51，-86保存3. 培养基 LB基本培养基平板4. SDS试剂(1) 30%丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于终体积为100ml的去离子水中，4保存。(2) 1.5Mol/L Tris-HCl pH 8.8：18.15g Tris碱，溶于去离子水中，

2、浓盐酸调pH至8.8，定容至100ml。(3) 0.5Mol/L Tris-HCl pH 6.8：6g Tris碱，溶于去离子水中，浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml。(4) 5电泳缓冲液(pH8.3)：Tris碱45g，甘氨酸216g，SDS 15g，溶于终体积为3 000ml的去离子水中，4保存。使用时5倍稀释。(5) 2上样缓冲液：SDS 500mg，-巯基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚蓝4mg，0.5Mol/L Tris-HCl pH 6.8缓冲液2ml，加去离子水至10ml。(6) 染色液：甲醇500ml，冰乙酸100ml，考马斯亮蓝2.5g，加水至1000ml。(7) 脱色液：甲

3、醇250ml，冰乙酸70ml，加水至1000ml。 5Western印迹试剂(1) 转移缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加水至总量为1 000ml。(2) 封闭液：含3%BSA的PBS。(3) 洗涤液：PBST(0.05%Tween-20)。(4) Tris平衡盐溶液：溶解8.77g NaCl于800ml 10mMol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，用缓冲液补足至1 000ml。(5) 4-氯-1-萘酚底物溶液：溶解30mg 4-氯-1-萘酚于10ml甲醇中，取2ml加至10ml Tris平衡盐溶液中，加5l 30% H2O2混合均

4、匀，5-10min内使用。(7) 氨基黑染色液：0.1%氨基黑，25%已丙醇，10%醋酸。6.其它试剂及配制(1) 10mMol/L萘啶酮酸钠：取250mg萘啶酮酸钠，溶解于终体积为10ml的去离子水中，滤过除菌，小量分装，-20保存。1Mol/L IPTG：取1g IPTG溶于3ml去离子水中，加水至4.2ml。滤过除菌，小量分装，-20保存。（二） 方法1.对数生长期E.coli X51的制备(1)冻干菌株的复苏及保存:同E.coli TG1。(2)对数生长期细菌制备:即挑取基本培养基平板上单个菌落至5ml LB培养基中，37、250rpm振摇培养过夜。取100l过夜培养物接种10ml L

5、B培养基，37、250rpm振摇培养至A600为0.3。2.重组质粒的制备 挑取-80冻存的鉴定为阳性克隆。3. SO7基因的可溶性表达 挑取LB上单个菌落至5ml新鲜制备的LB中，30、250rpm振摇培养过夜。4.表达产物的检测(1)SDS检测： 12%分离胶配制：双蒸水3.35ml，1.5MOL/L Tris-HCl (pH8.8)2.5ml，10%SDS 0.1ml，30%丙烯酰胺4.0ml，10%过硫酸胺50l，TEMED 5l；4%浓缩胶配制：双蒸水1.22ml，0.5MOL/L Tris-HCl (pH6.8)0.5ml，10%SDS 20l，30%丙烯酰胺0.26ml，10%过

6、硫酸胺10l，TEMED 2l；待胶凝固后，取下梳子；样品加等量上样缓冲液混匀，100煮沸2min，12000rpm离心5min，上样后稳压条件下电泳，浓缩胶100V、分离胶150V，至溴酚蓝迁移到凝胶底部时，停止电泳；取出凝胶染色2-3小时后脱色，观察蛋白带。（2）Western-blotting检测：SDS结束后，取出凝胶，将在转移缓冲液中浸泡约30min与凝胶同样大小的Hybond膜和3mm滤纸按海绵垫-滤纸-凝胶-Hybond膜-滤纸-海绵垫的结构，装入转印夹中，各层间不能有气泡。转印时凝胶侧接负极，Hybond膜侧接正极，转印电泳槽置冰浴中，200mA恒流转印1小时；转印结束后，按加

7、样孔的位置，剪下分子量标准的膜条用氨基黑染色，观察转印效果。其余部分置于封闭液中室温振摇1小时；取出后置于用封闭液稀释为1：1000的HRP兔抗鸡IgG-HRP结合物中，室温振摇1小时；取出膜用洗涤液洗6次、蒸馏水1次、双蒸水1次，每次30秒；最后将膜浸入至底物溶液中直至适中的颜色出现；用蒸馏水、双蒸水冲洗终止反应。结果判定SO7基因表达产物为26KD，所以在蛋白Marker 显示的26KD处应有一条目的带。但如果所用的抗血清不纯，就有可能在还有其它非特异性条带出现，这可能是菌体蛋白与血清中抗体结合的原因。在本实验所作的Western-blotting分析中显示，除了所需的与SO7表达蛋白相配的