虎杖指纹图谱定性与有效成分定量研究

1、虎杖指纹图谱定性与有效成分定量研究中南林业科技大学 向荣1，孙琴1，乔志斌2，周钰珂2（1. 中南林业科技大学 生命科学与技术学院 2012级生物技术专业，湖南 长沙 410004；2. 中南林业科技大学 生命科学与技术学院 2013级生物技术专业，湖南 长沙 410004）王元清 讲师，余蓉 讲师 摘要：目的 构建虎杖指纹图谱与定量分析虎杖中6种活性成分，为其质量控制提供方法。方法 采用HPLC法建立11批虎杖饮片的化学指纹图谱；采用总量统计矩法计算指纹图谱的总量零阶矩（AUCT）、总量响应率(AUCPWT)、总量一阶矩(MCRTT)、总量二阶矩(VCRTT)等参数及相似度评价。结果 对11

2、批虎杖饮片进行测定，共标定了13个共有峰，指认了6个色谱峰；总量统计矩参数AUCT、AUCPWT、MCRTT、VCRTT的平均值分别为：1.52106 AUmin、2.31103 AUminmLmg-1、2.20101 min、1.10102 min2；各批次样品的相似度在0.90以上。虎杖苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的平均含量分别为12.99 mg/g、4.21 mg/g、15.96 mg/g、0.12 mg/g、9.52 mg/g、1.99 mg/g。结论 化学指纹图谱结合总量统计矩分析与多成分定量可控制虎杖饮片质量。 关键词：虎杖；指纹图谱；总量统计矩；成分分析虎杖

3、为蓼科植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc)的干燥块茎和根1，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰功效1。虎杖中主要含蒽醌类和二苯乙烯（芪）类成分，其中蒽醌类成分主要为大黄素苷、大黄酸、大黄酚、大黄素和大黄素甲醚等蒽醌类衍生物，芪类成分主要为白藜芦醇、虎杖苷等2，具有抗炎、抗氧化3、抗癌、抗肿瘤4等功效。为控制虎杖的质量，本文构建虎杖化学指纹图谱后首次采用总量统计矩结合6种成分同时定量分析，从而为虎杖饮片质量控制提供参考方法。一 材料与仪器1. 药品与试剂虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚对照品(均购自南昌贝塔生物科技有限公司）、大黄酸、大黄素苷(均购自

4、南京泽朗医药科技有限公司)；虎杖（经鉴定为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc的干燥根，分别购于长沙11家药房)，乙腈(色谱纯，美国天地公司)；娃哈哈纯净水 (杭州娃哈哈有限公司 )；其他均为分析纯。2. 仪器 安捷伦1260高效液相色谱仪（Agilent公司，美国）；粉碎机（浙江省永康市金穗机械制造厂）；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP114型电子分析天平(奥豪斯仪器有限公司，0.0001g)；HH-600型三用恒温水箱（金坛市神科仪器厂）；SHZ-D（）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。二 方法与结果1.

5、色谱条件安捷伦色谱柱C18柱（250 mm4.6 mm，5m）；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脱；检测波长为变波长；流速0.8 mL/min；柱温30。色谱图见图1。图1 虎杖对照品（A）与样品（B）的HPLC图1-虎杖苷； 2-白藜芦醇；3-大黄素苷；4-大黄酸；5-大黄素；6-大黄素甲醚2. 供试品溶液的制备称取虎杖粗粉约0.5 g，置于50 mL量瓶中，加入甲醇超声30 min，冷却，静置，定容，摇匀，0.45 m微孔滤膜过滤即得供试品溶液。3. 对照品溶液的制备精密称定虎杖苷、白藜芦醇、大黄素苷、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚各对照品适量，分别置于棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀

6、释，分别制备成虎杖苷（64 g/mL）、白藜芦醇（71 g/mL）、大黄素苷（73 g/mL）、大黄酸（0.35g/mL）大黄素（74 g/mL）、大黄素甲醚（25g/mL）的对照品溶液。4. 方法学考察按照中国药典2010年版方法进行精密度、稳定性、重现性实验等，各RSD均小于3%，表明方法学考察合格。5. 指纹图谱的建立（1） 指纹图谱共有模式的建立 将11个不同批次虎杖HPLC色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A软件，建立了不同批次虎杖的指纹图谱共有模式，结果见图2。由图2可知，共获得13个共有峰，经化学对照品对照，1号、4号、6号、11号、12号、13号峰分别为虎杖苷、白

7、藜芦醇、大黄素苷、大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的峰，各批次样品中12号峰（大黄素）的峰面积较大，分离度较好，为各批次样品所共有，因此确定大黄素峰为参比峰。图2 虎杖HPLC指纹图谱色谱图（2） 共有峰的相对峰面积以各批次的12号峰(大黄素)为参照峰，计算同一图谱中各共有峰的相对峰面积，113号峰的平均相对峰面积分别为：1.304、0.1398、0.0729、0.7945、0.0432、1.3059、0.1952、0.1900、0.1591、0.0314、0.0043、1.0000、0.1877。（3） 总量统计矩分析采用指纹图谱的一种定性定量研究新方法：总量统计矩分析法计算不同批次的虎杖样品的总

8、量统计矩参数，如总量零阶矩（AUCT）、总量响应率(AUCPWT)、总量一阶矩(MCRTT)、总量二阶矩(VCRTT) 5等，计算结果见表1 。表1 各批次虎杖样品的总量统计矩参数样品号参 数AUCT(AUmin)AUCPWT(AUminmLmg-1)MCRTT(min)VCRTT(min2)1号1.411062.331032.011011.191022号1.711062.581032.211011.161023号1.561062.121032.451011.081024号1.321061.911032.301011.261025号1.941062.871032.241011.001026号1

9、.771062.771032.131010.971027号1.461062.251032.151011.131028号1.291061.941032.211011.081029号1.381062.181032.101011.0010210号1.551062.461032.101011.0810211号1.341061.961032.281011.18102平均1.521062.311032.201011.10102由表1可知，总量统计矩参数可以定量评价不同批次虎杖的指纹图谱，各批次样品存在较大的差异。（4） 相似度评价 分别采用总量统计矩法 6对11批虎杖样品的HPLC指纹图谱进行相似度评价，

10、结果见表2。结果表明各批次虎杖样品具有较高的相似度。表2 总量统计矩法计算各批次虎杖样品的相似度样品1号2号3号4号5号6号7号8号9号10号11号平均相似度0.9500.9520.9480.9610.9590.9490.9510.9420.9040.9600.9276. 虎杖中6种成分的平均含量 采用外标法对不同批次虎杖中6种成分进行定量分析，其平均含量见表3。 表3 各批次虎杖样品各成分平均含量成分虎杖苷白藜芦醇大黄素苷大黄酸大黄素大黄素甲醚平均含量(mg/g)12.994.2115.960.129.521.99可见，6种成分平均含量高低依次为：大黄素苷虎杖苷大黄素白藜芦醇大黄素甲醚大黄酸

11、。三 讨论本文构建了虎杖化学指纹图谱并同时定量了虎杖中的6种活性成分，为虎杖的质量控制提供了新方法。指纹图谱的识别模式中首次采用定性定量方法之总量统计矩法，它具有抗干扰性、加合性与偶联性等特点，能消除操作方法的干扰，能与多维向量偶联构成谱学的特点5，所以可以作为评价指纹谱图的方法。研究中发现各批次样品的总量统计矩参数如AUCT、AUCPWT、MCRTT、VCRTT差异较大，表明各批次样品在“量”上存在较大的差异。相似度研究中，首次采用总量统计矩法计算出了各批次样品之间的相似度，表明各样品在“形”上存在较高的相似性。参考文献1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典S. 一部. 北京: 中国医药科

12、技出版社, 2010：145-146.2 裴莲花, 吴学, 金光洙. 虎杖化学成分及药理作用研究现状J.延边大学医学学报, 2006, 29(2): 147-149.3 Lanzilli G, Cottarelli A, Nicotera G, et al. Anti-inflammatory effect of resveratrol andpolydatinby in vitro IL-17 modulation J. Inflammation, 2012, 35(1): 240-8.4 Mitani T, Harada N, Tanimori S, etal. Resveratrol inhibits hypoxia-inducible factor-1-mediated androgen receptor signaling and represses tumor progression in castration-resistant prostate cancer J.