香蕉枯萎病菌4号小种拮抗细菌的初步筛选及鉴定

1、香蕉枯萎病菌4号小种拮抗细菌的初步筛选及鉴定论文摘要：从香蕉根际土中别离得到87株细菌菌株，采用平板对峙法，筛选出7株对香蕉枯萎病菌4号生理小种具有拮抗作用的菌株，并进行了抑制枯萎病菌4号小种菌丝生长和孢子萌发的试验。结果显示，拮抗菌株255、D5、F2、ZK11、214、215、252的发酵液对香蕉枯萎病菌4号小种菌丝具有显著抑制效果，在平板上产生的抑菌圈直径到达17.90 22.88 mm，并能使病菌菌丝产生畸形或泡囊状；对孢子萌发的抑制率到达64.40% 80.50%。通过对3株抑菌作用不同的拮抗菌株的16S rDNA鉴定和生理生化特性鉴定，结果显示，拮抗菌株255、D5和F2分别被初步

2、鉴定为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus、苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis和地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。论文关键词：香蕉枯萎病菌,号小种,拮抗细菌,基因,鉴定关键词：香蕉枯萎病菌；拮抗菌；16SrRNA基因；鉴定香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型Fusariumoxysporumfsp.cubense侵染而引起香蕉维管束坏死的一种真菌病害。目前在香蕉枯萎病的防治方面，缺乏有效的化学防治试剂，农业防治措施也不能到达较理想的效果。因此，生物防治作为一种经济、平安、有效的防治措施成为了研究的热点。目前，对于香蕉枯萎病生物防治的研究主要集

3、中于香蕉枯萎病拮抗菌的筛选及其室内盆栽防治试验。Thangavelu等报道获得对香蕉枯萎病的防治效果为48%51%的哈兹木霉(Trichodermaharzianum)，获得防治效果为41%荧光假单孢杆菌Pseudomonasfluorescens能诱导植物产生系统抗性抑制香蕉枯萎病，枯草芽孢杆菌也有较好的防效。曹理想等报道，在研究香蕉内生菌区系时，发现几株玫瑰浅灰链霉菌(Streptomycesroseogriseolus)对香蕉枯萎病菌有一定拮抗作用。本试验旨资助工程：广东省农业厅(粤农函2006-229)在从香蕉根际土壤中筛选出对香蕉枯萎病菌具有拮抗作用的生物防治细菌菌株，并对其拮抗作用

4、和分类地位进行研究，为香蕉枯萎病生物制剂的开发打下根底。1材料与方法1.1材料1.2方法 孢子萌发抑制率%= 对照平均孢子萌发率-处理孢子萌发率 x100 对照平均孢子萌发率 PCR反响体系50L：TaqTMDNA聚合酶(2U/L)1l，10 xPCR缓冲液含Mg5.0l，dNTPMasterMix(200mol/L)1l，PrimerF(上游引物5pmol/L)1l，PrimerR(下游引物5pmol/L)1l，DNA模板2l，ddHO补足50l。PCR反响条件：95预变性7min：94变性45s，54退火45s，72延伸90s，循环30次；72终延10min，4保存。取4lPCR产物用1%

5、琼脂糖电泳90V/50min检测，紫外灯下观察DNA条带。目标片段由上海生物技术工程测序。测序结果登陆GenBank，进行BLAST比对。从不同香蕉根际土中别离得到细菌87株，通过与香蕉枯萎病菌的对峙培养45d后，共筛选出对香蕉枯萎病具有抑制作用的细菌7株，分别是：255、D5、F2、ZK11、214、215、252。在PDA平板实验中，这7株细菌能对香蕉枯萎病菌菌丝产生明显的抑菌作用，靠近拮抗菌一侧的菌丝生长速度变缓或停止，并产生明显的透明抑菌带，或者在抑菌带边缘产生绿色的色素。表1拮抗细菌对香蕉枯萎病菌的平板抑制作用 处理 Treatment 抑菌圈直径/mm diameter of in

6、hibitive zone/mm 平均值 Average/mm 差异显著性 different significance 0.05 0.01 255 24 20 22 21.5 22.88 ab* AB D5 19 18.5 18 20 18.00 c BC F2 20 23 24 22 22.25 a A* ZK11 22 23 20 21 21.50 ab AB 214 22 20 19.5 20 20.37 bc ABC 252 24 21 20.5 20 21.38 ab AB 215 18 17.5 18.5 18 17.90 c C 对照 0 0 0 0 0 d D *：同一列中不

7、同字母表示在5%或1%水平存在显著性差异*:Differentlettersinthesamecolumnrepresentsignificantdifferenceatlevelof5%or1%2.2拮抗细菌对香蕉枯萎病菌菌丝的作用方式在抑菌带交界处挑取局部菌丝块于显微镜下观察，被拮抗细菌抑制生长的菌丝主要出现3种不同形态 spores germination rate (%) 平均值 Average 差异显著性 Different significance 抑制率% Inhibitive rate% 0.05 0.01 255 26.5 23.0 29.0 25.0 25.6 Cd* BC

8、D* 68.0 D5 30.5 39.0 38.5 29.5 34.4 bc B 57.4 F2 14.0 22.5 20.5 21.0 19.1 d D 75.9 214 18.5 26.0 29.5 12.5 21.8 d CD 73.2 215 31.5 29.0 43.0 39.0 35.1 b B 55.9 252 22.5 19.5 19.0 24.5 21.2 d CD 73.5 ZK 31.0 23.0 40.5 34.5 32.2 bc BC 60.1 CK (NB) 73.5 91.5 75.0 83.0 81.7 a A 0.0 *：同一列中不同字母表示在5%或1%水平存

9、在显著性差异*:Differentlettersinthesamecolumnrepresentsignificantdifferenceatlevelof5%or1%2.4拮抗细菌的鉴定利用细菌16SrRNA基因通用引物对3株抑菌作用不同的拮抗细菌菌株16SrDNA进行扩增，获得大约1.5kb的特异性条带。通过与NCBI数据库中的模式菌株16SrDNA序列进行相似性比拟，结果显示，拮抗菌株255的16SrDNA序列长度为1462bp，与芽孢杆菌属Bacillussp.的序列相似度到达99%，与蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus同源性到达99%，与苏云金芽孢杆菌同源性Bacillusth

10、uringiensis到达98%；拮抗菌株D5的16SrDNA序列长度为1052bp，与芽孢杆菌属Bacillussp.相似度到达99%，与苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis的相似性到达99%，与蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus同源性也到达99%；拮抗菌株F2的16SrDNA序列长度为1062bp，与芽孢杆菌属Bacillussp.的序列相似度到达99%，与地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis、解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis的相似性到达99%。拮抗菌株F2在营养琼脂培

11、养基上呈乳白色不透明，外表粗糙皱褶，菌体边缘不整齐。细菌菌体呈杆状，单生，菌体长度约为22.5m，菌体直径小于1m，可产生近中生的椭圆形芽孢，无伴孢晶体图2-A；革兰氏染色阳性，在含葡萄糖或甘露醇的培养基上产酸，淀粉水解呈阳性，能利用柠檬酸盐，吲哚试验呈阴性表3。A:拮抗菌株F2B:拮抗菌株D5C:拮抗菌株255A:strainF2B:strainD5C:strain255图2拮抗菌株的芽孢形态Fig.2sporangiummorphologyofantagonisticbacterium拮抗菌株D5在营养琼脂培养基上呈白色，外表无光泽，不透明。菌体呈杆状，链状排列图2-B，菌体长度约为34m

12、，直径约为11.5m；有伴孢晶体，革兰氏染色阳性，在含葡萄糖的培养基上产酸，在含甘露醇的培养基上不产酸，淀粉水解呈阳性，能利用柠檬酸盐，吲哚试验呈阴性(表3。拮抗菌株255在营养琼脂培养基上呈乳白色，外表稍有光泽，扁平的圆形菌落。细菌菌体呈杆状，链状排列图2-C，菌体长度为34m，直径约为11.5m，可产生近中生的芽孢，芽孢略膨大；革兰氏染色阳性，无伴孢晶体，在含葡萄糖的培养基上产酸，在含甘露醇的培养基上不产酸，淀粉水解呈阳性，能利用柠檬酸盐，吲哚试验呈阴性表3。表3拮抗菌株的生理生化特性Tab.3biochemicalcharacteristicofantagonisticbacterium

13、 特征 Character 菌株255 Strain 255 菌株D5 Strain D5 菌株F2 Strain F2 革兰氏反响 Gram reaction + + + 从D-葡萄糖产酸 Acid production from D-dextrose + - + 从D-甘露醇产酸 Acid production from D-mannitol - - + 利用柠檬酸盐 Application of citrate + + + 产生吲哚 Production of indole - - - 厌氧生长 Anaerobic + + + 芽孢圆形 Round spore - - - 伴孢晶体 Pa

14、rasporal crystal - - - 淀粉水解 Starch hydrolysis + + + 注：表中+;表示阳性，-;表示阴性通过对拮抗菌F2的16SrDNA序列分析，拮抗菌F2与地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis、解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis的相似性到达99%，再结合拮抗菌F2的生理生化试验结果，参考?伯杰氏系统细菌学手册?，拮抗菌F2初步鉴定为地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis。通过对拮抗菌D5的16SrDNA序列分析，拮抗菌D5与蜡状芽孢杆菌Bacillu

15、scereus的相似性为99%，再结合拮抗菌D5的生理生化特征，拮抗菌D5初步鉴定为苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis。通过对拮抗菌255的16SrDNA序列分析，拮抗菌255与蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus的相似性到达99%，与苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis的相似性到达98%，再结合拮抗菌255的生理生化试验结果，初步鉴定拮抗菌255为蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus。3讨论在自然界中，细菌与真菌之间的拮抗现象普遍存在。利用微生物菌剂来防治植物病害具有高效、经济、无副作用等优点，并且在长期的进化过程中，存在于植物根际的微生物与

16、植物之间建立了密切关系，其中一些细菌能对病菌产生抑制作用。Pereze-Vicente等获得对香蕉枯萎病菌抑制效果到达95%的哈兹木霉Trichodermaharzianum，Ting等还别离到对香蕉枯萎病菌有较强抑制作用的绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa、粘质沙雷菌Serratiamarcescens、荚壳布克氏菌Burkholderiaglumae。孙正祥等报道其别离的拮抗细菌对香蕉枯萎病的相对抑制率到达76%。本试验从香蕉根际土中别离出7株拮抗细菌对香蕉枯萎病菌4号小种具有较高的抑制效果，对孢子萌发的抑制率为64.40%80.50%。另外，还发现拮抗细菌能引起香蕉枯萎病

17、菌分生孢子芽管畸形，使病菌菌丝细胞膨大，细胞破裂，菌丝体断裂散生，从而导致枯萎病菌菌丝生长受到抑制，这与肖爱萍等的报道一致。孙正祥等通过对拮抗菌16SrDNA的分析，鉴定其别离的对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的菌株为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。杨秀娟等从果园筛选得到3株对香蕉枯萎病菌有抑制作用的拮抗菌，通过对3株拮抗菌的生理生化反响试验，初步鉴定为芽孢杆菌属细菌。本试验通过对拮抗菌16SrDNA的序列分析和生理生化特征对拮抗细菌进行鉴定，初步鉴定结果是：拮抗菌株D5、F2、255分别为苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis、地衣芽孢杆菌Bacilluslichen

18、iformis、蜡状芽孢杆菌Bacilluscereus。苏云金芽孢杆菌主要是用于害虫的防治，也有报道它对植物病原真菌-胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)具有抑制作用，本研究也证实苏云金芽孢杆菌对植物病原真菌具有抑制作用，但能否用于大田防治，还有待进一步研究。地衣芽孢杆菌对多种植物病原菌具有抑制作用。唐丽娟等报道地衣芽孢杆菌对灰葡萄孢的田间防治效果到达60%以上，李玉峰等报道地衣芽孢杆菌代谢物对马铃薯晚疫病菌具有明显抑制效果，本研究也证实地衣芽孢杆菌对香蕉枯萎病菌具有抑制作用。蜡状芽孢杆菌对植物病原菌具有抑制效果的报道较少。但陈冲等报道蜡状芽孢杆菌可抑制白

19、粉病的定殖，从而到达防治白粉病的效果；李柏青等报道将蜡状芽孢杆菌与青枯雷尔氏菌强致病力菌株进行共同培养后，青枯雷尔氏菌强致病力菌株丧失致病力。本研究证实蜡状芽孢杆菌对香蕉枯萎病菌具有抑制作用，但能否应用于生产，还有待进一步研究。本试验中拮抗菌的鉴定仅是通过拮抗菌的16SrDNA序列和生理生化反响进行的初步鉴定，仍需利用分子杂交方法对拮抗菌株进行准确鉴定。参考文献1 Thandavelu R,Palaniswami A,Doraiswamy S, et a1. The effect of Pseudomonas flourascens andFusarium oxysporum f.sp. cu

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21、ang zhong-da. Research method of phytopathology (3rd Edition). Beijing: China Agricultural Science Press, 2001,182.4 Xiao Aiping You Chunping Liang Guanping , et al. Selection of the antagonisticbacteria against Fusarium oxysporum f. sp. Cubense and their actionmechanisms. Plant Protection, 2006,32(

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