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文档简介

1、作物抗冻基因及生理研究进展论文摘要:冻害是指零下低温对植物造成的伤害。由于全球气温上升,极端温度出现的频率增加引起农业冻害的发生,例如北方春季倒春寒,南方冬季出现的冻雨严重地抑制了农作物的生长,甚至颗粒无收。提高作物的抗冻性以维持农业的可持续性开展是植物育种学家面临的重大课题。为了能更有效加快作物抗冻育种工作以利于我国形成稳定农业生产,本文中就近年来国内外农作物在抗冻基因,抗冻蛋白,以及抗冻生理生化机制研究进展方面作一较为系统的论述,从而为利用基因工程手段进行作物抗冻育种及有关生理的研究提供启示。论文关键词:农作物抗冻性,抗冻基因,抗冻蛋白,生理生化变化植物为抵抗冰点以下的低温使植物组织内结冰

2、引起的伤害称为冻害。低温冻害是农作物减产的重要因素,全球每年因低温寒害造成许多农作物的损失高达数千亿美元。研究并提高作物抗冻能力,培育出抗冻作物品种在增加作物抵御骤然低温能力,维护作物产量,维持农业的持续开展显得非常重要。因此,作物抗冻性研究具有着重要的科学理论意义和应用价值。长期以来,人们从植物生理学、遗传育种学、形态学、生物化学、细胞生物学及分子生物学等多方面对植物抗冻机理进行了广泛的研究。近年来,随着对抗冻机理的认识不断加深,分子生物学及生物化学技术的开展与渗透,有关低温诱导特异蛋白质及其相关基因的克隆、应用与作物抗冻性关系方面已取得了突破性进展。本文就作物对低温胁迫的抗冻基因、抗冻蛋白

3、、生理生化变化等方面的研究进展作一概述,从而为利用基因工程手段进行植物抗冻育种及有关生理的研究提供了新的启示,也为作物增产提供理论依据。1与作物抗冻相关的抗冻基因1.1COR基因表达提高农作物的抗冻性的抗冻基因很多,但是目前农业上研究较多的是COR(Coldregulated)冷诱导基因,如COR15a、COR78、COR6.6、COR47等,对COR15a基因研究比拟深入。Artus等对拟南芥COR15a基因的研究为冷诱导基因的抗冻作用首次提供了直接的证据。该研究发现,未经低温锻炼的转基因拟南芥植株中COR15a的表达可使叶绿体的耐冻性增强,其耐受的低温限度从-2-4C增加到了-5-8C。为

4、了进一步鉴定COR15a基因的调控机理,Artus等用CaCl和缓冲液洗过的样品放入试管,然后参加酒精在-2C冰浴15分钟,试管外形成冰的悬浮,再经30分钟等温处理后,样品以每分钟0.8C速度下降。在此过程中,用双醋酸荧光素染色检查原生质体质膜的半通透性。结果显示COR15a基因表达的原生质体膜半通透性明显低于未转基因型植株,这说明COR15a的表达对膜起保护和稳定作用。低温对细胞膜的损伤主要原因是由于冰冻引起的细胞脱水而导致膜的脂双层向六角形II相转变以及膜的破裂,而COR15a的表达增强可减少质膜遇低温时所产生的由脂双层向六角形II相转变的机率。研究进一步发现,COR15a通过降低了二油磷

5、脂酰乙醇胺向六角形II转相变的温度,并改变叶绿体被膜内膜的弯曲性,从而减少对膜的伤害。减少膜的伤害可使植株存活率提高,Puhakaine等用电击法通过农杆菌pGV2260,将COR15a基因侵染拟南芥。研究发现,低温条件下,转基因拟南芥植株比对照植株降低了LT5,并且转基因植株的存活率也明显高于对照植株。但也有特殊,Jaglo-Ottosen的研究发现,虽然COR15a转基因拟南芥的抗冻性提高了,但植株的抗冻力提高并不显著。他们认为,这可能由于单个COR15a基因缺乏以明显提高植株的抗冻能力,植物的抗冻性是由多基因共同作用的效果。COR其它基因的表达也能增强抗冻性。前人研究发现,转基因的马铃薯

6、没有低温刺激由于CBF过表达诱导COR表达使脯氨酸和总含糖量增加而增强植株抗冻性。COR19转入烟草,和对照烟草植株相比拟,转基因植株电渗值较低、发芽率较高、抗冻性有所提高。对小麦低温处理,在20C生长4周后,每两天降低4C,降到12C到达COR14b最正确水平,这说明低温诱导小麦COR14b水平升高使抗冻性增加。1.2CRT/DRE调节诱导增强农作物抗冻性从转基因的拟南芥中发现,由于CBF1/DREB1b或CBF3/DREB1a基因的超表达,使上述含有CRT/DRE调节元件的冷相关基因能在正常温度环境中表达,这种含有CRT/DRE调控元件并由CBF/DREB1转录活化因子诱导表达的基因称为C

7、BF调控元件。Stockinger等首次别离了结合CRT/DRE序列的蛋白质的cDNA,分子量为24kD,具有两组分的核定位序列和作为激活结构域的酸性区域。CRT/DRE调节元件相互作用,调节启动子区域含该顺式作用元件的基因的表达,主要在低温和短日照下启动表达,使细胞表现出抗冷能力。Gilmour等研究发现,拟南芥暴露在低温下,迅速诱导CBF目的基因表达,CBF调节子CRT/DRE致使植物抗冻性增强,用Northernblot分析证明,CBF调节子由COR基因和该基因启动子中的CRT/DRE顺式作用元件共同组成。低温时ICE被激活,激活的ICE能特异地结合到CBFs基因的启动子上,诱导CBF/

8、OREB1基因的转录产生CBF/DREB1,进一步作用于COR基因的启动子内CRT/DRE顺式作用元件,使低温应答基因开始转录、表达,从而使植物产生抗寒性。1.3CBF表达增强农作物冷冻适应性CBF(C-repeat-bindingfactors)基因家族是一个包括CBF1、CBF2、CBF3、CBF4的小基因家族,其成员在植物抗寒、抗旱及抗盐碱方面起着很大的作用。Gilmour等研究发现,CBF2突变体比正常植株抗寒性更强,且CBF1与CBF3的表达量增加;进一步研究发现,在低温下,CBF1和CBF3的表达量优于CBF2,但在常温下,CBF2的表达量比CBF2和CBF3高5-8倍。此外,CB

9、F1、CBF2、CBF3诱导使拟南芥中脯氨酸、可溶性糖含量增加从而使抗冻性增加。拟南芥在零下低温锻炼后,CBF1、CBF2、CBF3基因表达比未锻炼前有适度增加,这说明零下低温锻炼对抗冻性的提高更明显。Mckerdie将拟南芥中CBF3基因连到CaMV35S启动子、冷诱导启动子之后转入烟草中,结果发现烟草植株的抗冻性能力提高了。又有研究把拟南芥CBF基因转入到未经低温刺激的油菜中,结果发现油菜中CBF过表达使其抗冻性提高。而CBF在马铃薯抗冻调节功能上与拟南芥不同,只进行冷适应的马铃薯,由于抗冻锻炼过程不能启动马铃薯CBF响应从而植株抗冻性不能提高,但转基因的马铃薯CBF1和CBF3基因的表达

10、能改善其农艺学的重要特征的负面影响而增强抗冻性,这与转基因拟南芥作用一致。对茄科植物马铃薯CBF基因进一步研究发现,CBF1远比CBF2和CBF3上游基因保守,CBF1只在低温刺激下表达,而CBF2和CBF3对低温没有响应,研究说明CBF1的表达对增强茄科植物马铃薯抗冻性功能制约起关键作用。其它科属中CBF也有相似的作用,如两种的苜蓿在-4C14C低温诱导CBFs表达,但用杂交探针的方法研究发现CBFs表达不同,在6C冷诱导中CBF2和CBF3基因表达,而CBF1基因没表达。在小麦过冷条件中CBF2和CBF3的过表达和其抗冷性增强相关。CBF基因组启动转录和转译,产生与抗寒性有关的蛋白质产物,

11、采用蛋白质电泳检测技术别离鉴定了许多冷诱导过程中出现的特异蛋白质,下面介绍和作物抗冻的相关蛋白。2农作物抗冻蛋白与抗冻性研究2.1抗冻蛋白的生化特征抗冻蛋白(antifreezeproteins,AFPs)是一种具有热滞效应、抑制冰晶重结晶作用的特异表达蛋白,降低生物体细胞间和体液的冰点,防止了植物体结冰的伤害或致死。不同的植物AFPs它们的DNA和氨基酸序列却完全不同,几乎没有同源性。Griffith等第一次从冬黑麦中获得内源AFPs,AFPs有7个多肽组分具有明显的抗冻活性,5种较大分子量的多肽(16,25,32,34,36kDa)活性较高,而分子量为11,13kDa的2条多肽抗冻活性较低

12、,富含天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸,但缺少组氨酸、胱氨酸。Wallis,Worrall和尹明安等分别对胡萝卜的抗冻性进行深入研究,先后报道了胡萝卜中存在冷诱导的抗冻蛋白AFP的结构,它富集亮氨酸的质外体蛋白,由332个氨基酸组成,相对分子量为36.8x10,其N端是糖基化的,具有显著地抑制冰重结晶的功能。简令成等从沙冬青中别离纯化抗冻蛋白,分子量范围在21x1067x10,热滞活性0.150.46,它的抗冻活性比已经发现黑麦抗冻蛋白(在60mg/ml的浓度时冰点为-111)活性高得多。2.2抗冻蛋白的抗冻机理大量的实验研究推测AFPs在提高植物抗冻性方面

13、的抗冻机制主要为以下几个方面:1.降低原生质体的过冷状态;2.抑制冰晶的重结晶;3.调节胞外冰晶的生长形态;AFPs与包括冷诱导的热稳定蛋白在内的所有溶质相互作用,调节细胞质的状态,使过冷点降低,这可能是越冬植物细胞的主要抗冻调节方式。关于抗冻机理有多种学说,如1977年Raymond吸附抑制;模型,1983年,Deviles提出了晶格匹配;模型,1988年,Yang等人提出了偶极子偶极子;模型;1993年,Knight等人提出了品格占有;模型。这4个模型虽然侧重点各不相同,但是它们有着一个共同之处,即AFPs与冰晶之间通过氢键进行结合,只是氢键的数量和形成的方式不同而已。目前,解释抗冻蛋白机

14、理较好的理论是外表互补;模型理论,核心内容是AFPs的冰晶结合位点所形成的外表能与冰晶的外表形成互补。该模型理论认为,AFPs与冰晶之间所形成的外表互补与多种相互作用力有关,主要是疏水作用和范德华力,氢键起着次要的作用。较强的外表作用力使得AFPs与冰晶结合是不可逆的,这种不可逆性阻止了冰晶的生长。2.3抗冻蛋白的基因工程进入20世纪90年代后,随着抗冻性的研究深入,使用体内标记、代谢组学的技术基因芯片技术、蛋白质合成抑制剂及体外翻译等方法研究抗冻基因表达后合成的特异性蛋白多肽,试图别离纯化出低温特异性蛋白多肽,以获得其氨基酸序列,然后利用它作为探针,筛选出特异性基因,并期望将它用于改进某些作

15、物的抗冻性能。至今已在油菜、番茄、马铃薯、胡萝卜、卷心菜、黑麦、菠菜、小麦、大麦、玉米、水稻、桃树等多种农作物的低温诱导中观察到特异蛋白的合成。1990年,Georges等借助于电激法把冬比目鱼合成基因引入玉米原生质体,并在此原生质体中得到表达,在无细胞提取液中明显地鉴定到该抗冻蛋白。1991年Hightower等将北极鱼的抗冻蛋白基因导入烟草和番茄中,抑制细胞再结晶而使抗寒性增加。1997年,Wallis等将人工合成的比目鱼AFP基因以及AFP与编码植物凝集素pha基因的组成嵌合基因分别导入马铃薯,均能减少转基因马铃薯细胞在低温下电解质的渗漏。1998年,Worrall等首次利用植物基因进行

16、植物抗冻改进,将胡萝卜基因导入烟草,所获得的转基因烟草叶提取物能抑制冰晶生长从而提高作物抗冻性。随后,将抗冻蛋白基因再次被成功转入到烟草,转基因植株的抗冻性明显高于对照。2001年Holmberg等首次将云杉蚜虫抗冻蛋白(SbwAFP)基因与CaMV35s及胭脂碱合成酶基因组成嵌合基因后导入烟草,发现转基因烟草中质外体SbwAFP的表达能抑制冰晶重结晶,并提高了热滞活性。最近几年研究最多的是将菌的抗冻蛋白转入作物中,将曲霉菌的抗冻蛋白基因转移到水稻中,不仅提高水稻的抗冻性还增强了水稻对稻瘟病抵抗性。3作物生理生化变化研究3.1细胞膜的生理变化细胞膜是植物耐受低温和抵抗低温伤害的关键结构,细胞电

17、解质渗漏的多少常反响在低温下植物受伤害的严重程度。一些农作物比拟能忍受胞外结冰,其原因在于:细胞膜的抗冻性强阻止胞外冰晶向胞内生长。低温胁迫下,细胞膜不饱和脂肪酸含量增加,它能与细胞表层结合,阻止水分子透过,并调节质膜相变温度,有利于抵御冻害。抗寒锻炼后燕麦和黑麦不饱和脂肪酸增加,但黑麦比燕麦增加的多。抗寒锻炼后黑麦半乳糖基甘油二酯降低,双乳糖基甘油二酯和卵磷脂增高保护膜稳定性使其抗冻性增强,并且低温诱导,果聚糖增了加膜的稳定性并且降低膜的结晶率确保减少对膜的伤害。冷处理的小麦抗冻性增加,离子渗透性和存活率都增加,热处理的番茄也能减轻冷害导致离子渗漏的发生。低温胁迫初期油麦菜幼苗叶片的电解质外

18、渗率显著上升,但随着低温胁迫时间的延长略有下降。这说明油麦菜幼苗在一定程度上对低温胁迫有抵抗能力。3.2可溶性糖的变化许多研究认为,经低温锻炼后,植物体内可溶性糖有明显增加,这说明低温可以诱发可溶性糖的转化合成及积累。果梅不同品种间枝皮可溶性糖含量存在差异,越冬期间可溶性糖含量及变幅大小与品种抗寒性之间有一定的相关性。这与张纪林等研究结论一致:温度和植物中可溶性糖含量呈负相关。研究发现,与未转基因的玉米相比,转基因的玉米随低温处理时间延长叶中可溶性糖增加幅度增高。可溶性糖增加农作物抗寒性的生理作用是由于糖可以提高细胞质液的浓度使冰点下降,又可以缓冲原生质过度脱水,保持原生质体不遇冷凝固,还可以

19、缓解对膜有毒害物质的伤害。3.3脯氨酸与作物抗冻性游离氨基酸的存在使细胞液的浓度增加,从而对细胞起保护作用。此外游离氨基酸具有很强的亲和性,对原生质的保水能力及胶体稳定性有一定的作用。因此,脯氨酸作为重要的渗透调节物质,脯氨酸与植物抗寒性的关系受到广泛的关注。通过季节周期性对假山毛榉树实验室和野外的成年和幼苗做冷诱导和非冷诱导处理观察发现,野外和实验室的成年树种在秋天和冬天可溶性糖和脯氨酸含量升高,但是,不同物种幼苗在不同程度冷处理中叶中脯氨酸含量不同。除季节周期性处理外,短期处理也有同样的效果,冷适应一周后小麦脯氨酸含量增加,其幅度随着抗冻性的减弱而减少。低温处理后3、6、9、12天各西葫芦

20、品种幼苗叶片的脯氨酸含量均高于其对照,并随低温处理的延长而呈现出先下降后升高的趋势,而常温对照品种的脯氨酸含量前后较稳定。转基因的烟草在冷冻条件下处理24小时脯氨酸积累量增加,并且相关的氧化酶活性增强而减少了低温对植株的伤害。3.4保护酶与作物抗冻性农作物遇低温会积累大量对膜和膜相关的生物大分子有害的活性氧(AOS),抗冻锻炼可使农作物体内抗氧化物酶系统加强,从而减少活性氧对农作物的伤害。POD、SOD和CAT作为内源活性氧去除剂能够在低温逆境中去除过量的活性氧,维持其代谢平衡,保持膜结构的稳定性,从而消除或减轻伤害。茄子在低温胁迫POD活性增加明显,而CAT、SOD活性快速下降,加快了一些活

21、性氧与自由基的分解,迅速消除它们在组织内的不良影响提高植物的抗冻性。对玉米研究说明,低温胁迫下玉米超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等活性改变,使玉米其抗氧化系统活力增强;耐低温胁迫的能力也明显增强,说明低温对这些酶有一定诱导作用,而低温诱导产生的酶在一定程度上缓解了植物氧化性伤害;但随氧化程度的加重,植株细胞受到伤害加重甚至死亡,酶合成的量降低以及不断氧化,使酶含量和活性降低并最终失活。在酶促防御活性氧伤害的保护系统看,作为作物体内主要的抗氧化酶,SOD是植物细胞最重要的去除氧自由基的酶之一,主要功能是去除氧自由基,产生HO,而HO可与氧自由基相互作用产生更多的氧自由基,而POD

22、和CAT可以去除HO,维持活性氧代谢平衡,保护了膜系统,从而减缓或抵抗了逆境胁迫。将SOD基因转入紫花苜蓿提高了SOD活性增加耐冻性。在冰冻解冻循环中SOD活性高于春小麦,是因为冬小麦抗冻性高于春小麦。3.5甜菜碱与作物抗冻性甜菜碱(Betains)是重要的渗透调节物质,它是一种季胺类化合物,不仅在植物受到低温胁迫时在细胞内积累以降低渗透势,还能作为一种保护物质维持生物大分子的结构和完整性,维持其正常的生理功能。低温胁迫条件下作物的生长发育具有如下保护作用:1.维持低温条件下酶的活性;2.通过保持光系统II复合体蛋白的稳定性来保持低温胁迫下光系统的活性。对大麦冬、春2种类型近等基因系在冷适应过

23、程中的甜菜碱积累情况研究说明,甜菜碱水平随冷处理时间的延长而增加,且不同叶位间存在明显差异,新生叶甜菜碱的积累量显著高于老叶片,其积累量随胁迫时间延长而增加的趋势明显,老叶片不仅积累少,对胁迫时间的延长也根本没有反响。4展望1农作物抗寒性在生理生化方面的表现,最终由体内基因表达来控制,所以基因方面的研究有利于从根本上改善农作物的抗寒性。在选择外源基因时,应考虑外源基因是否与植物内源基因相互协调,一般以导入与植物同源性强的基因为佳,同时也应注意解决转基因作物沉默的问题。CBFs基因是受低温诱导的,但其诱导机制还不太清楚,有待进一步研究。2AFPs蛋白在植物抗冻中其重要作用,作用机制和其调节信号途

24、径尚不清楚,有待进一步探讨。如何从植物中别离出更多的、活性更高的AFP,并通过遗传转化将其导入抗寒性弱或不抗寒植物中进而获得抗寒性强的转基因植株,将是今后植物抗寒性基因工程研究的主要内容之一。目前,在抗冻基因工程方面已从鱼类抗冻基因途、脂肪酸去饱和代谢关键酶基因途径、超氧物歧化酶基因途径、糖类基因途径4个方面取得了一定的进展,其潜在的应用前景是不言而喻的。随着温室效应的增强,暖冬出现的频率越来越高,这一气候变化对植物和农业生态系统的影响还不能确定,这些内容有待于今后深入研究。参考文献1 利容千, 王建波. 植物逆境细胞及生理学. 武汉: 武汉大学出版社. 2002:140-141.2 LIN

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