色谱分离技术

1、第八章 色谱分离技术1主要内容色谱分离技术概述 色谱技术的基本概念 色谱技术的理论基础 色谱法的分类 色谱技术的操作方法吸附色谱法分配色谱法亲和色谱法2 第一节 色谱分离技术概要色谱技术的起源:1903年Tswett首创叶绿素的石油醚溶液通过碳酸钙管柱,并继续以石油醚淋洗,由于碳酸钙对叶绿素中各种色素的吸附能力不同,色素被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色的谱带。命名为色谱法(Chromatography)石油醚 白色阳光通过棱镜后变成红、 橙、黄、绿、青、蓝、紫七色彩带 光谱（光的色散）31931年 Kuhn 和Lederer用氧化铝和碳酸钙分离了-、-、-胡萝卜素1940年 Martin和S

2、ynge提出了液液分配色谱法1944年 Consden发展了纸色谱法1949年 Macllean发展了薄层色谱法1952年 James和Martin发表了完整的气液色谱方法, 获1952年的诺贝尔化学奖1956年 Van Deemter发展了描述色谱过程的速率理论1957年 Golay开创了开管柱气相色谱法60年代末 高压泵和化学键合固定相用于液相色谱法，出现了HPLC80年代初 毛细管超临界液体色谱发展，毛细管电泳的出现 90年代 结合 HPLC高选择性和CE高效的优点的毛细管电色谱出现发展历史4 色谱技术的发展分离对象： 不限于有色物质色谱柱： 材料：玻璃、不锈钢、聚四氟乙烯 形状：直形、

3、U形、螺旋形 二维平面形（纸、薄层色谱）冲洗剂： 液体、气体填料： 近千种 固体、液体检测： 眼睛、各种检测器操作： 手工 全自动 联用技术 5气相色谱（1952年）1-载气钢瓶；2-减压阀；3-净化干燥管；4-针形阀；5-流量计;6-压力表；7-气化室；8-色谱柱9-热导检测器；10-放大器；11-温度控制器；12-记录仪；1. 载气系统：包括气源、净化干燥管和载气流速控制;2. 进样系统：进样器及气化室；3. 色谱柱：填充柱（填充固定相）或毛细管柱（内壁涂有固定液）；4. 检测器：可连接各种检测器，以热导检测器或氢火焰检测器最为常见；5. 记录系统：放大器、记录仪或数据处理仪；6. 温度控

4、制系统：柱室、气化室的温度控制。6色谱系统特点是分离效率高，能分离性质极性类似的物质，既能用于少量物质的分析鉴定，也可用于大量物质的分离纯化制备。7一、色谱技术的基本概念利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性、分子大小、带电情况、离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数不同，达到彼此分离的目的。加入洗脱剂使各组分分层的操作称为展开。洗脱时从柱中流出的液体称为洗脱液。展开后各组分的分布情况称为色谱图。将样品加到柱上的操作称为上样或加样。8A+B+CABCCBACBACCB图11-1 色谱洗脱过程与色谱图t，minABC信号9（一）固定相可以是固体

5、物质（吸附剂，凝胶，离子交换剂），也可以是液体物质（固定在硅胶或纤维素上的溶液）组成： 空间结构部分：决定固定相尺寸与孔隙率； 化学和生物大分子功能性成分：决定介质与目标溶质特异性相互作用的能力。 P175表8-110 （二）流动相推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界流体。柱色谱中称为洗脱剂，薄层色谱中称为展开剂。11正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性。非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动速度快，先从柱中流出来。反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种色谱过程中，极性大的分子比极性小的分子移动速度快而先从柱中流出。分离纯化极性大的分子，采用正相色谱；

6、分离纯化极性小的有机分子，采用反相色谱。12（三）分配系数，分配比和选择因子1、分配系数：在一定条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值。它是色谱中分离纯化物质的主要依据。langmuir无论色谱分离的机理如何，当溶质浓度较低时，固定相浓度和流动相浓度成线性的平衡关系。K的不同是由于各组分在固定相中的溶解度（气-液色谱）或吸附能力（气- 固色谱）不同而造成的。13影响因素：1、被分离物质本身的性质。K越大，出峰越慢，K0时，最先流出。2、固定相和流动相的性质3、色谱柱的温度温度升高20，K下降一半，常用恒温柱14 在实际工作中另一表征色谱分配过程的参数。是指在一定温度、压力下，在两

7、相间达到分配平衡时，组分在两相间的质量比，用k来表示：式中VM和VS分别为柱中流动相和固定相的体积，为体积比。2、分配比（容量因子或容量比）15 （1）分配系数是组分在两相间分配达到平衡时的浓度之比，分配比则是组分在两相间的分配总量之比。 （2）分配系数决定于组分和两相的性质，与两相体积无关。分配比不仅决定于组分和两相的性质，且与两相体积比有关。 （3）对于一给定的色谱体系，组分的分离最终决定于组分在每相中的相对量，而不是相对浓度，因此分配比是衡量色谱柱对组分保留能力的重要参数。163. 选择因子 色谱柱对A、B两组分的选择因子 定义如下：A为先流出的组分，B 为后流出的组分。17K 或 k

8、反映的是某一组分在两相间的分配； 是反映两组分间的分离情况。两组分 K 或 k 相同时， =1 时，两组分不能分开；两组分 K 或 k 相差越大时， 离1越远，分离得越好。两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。 和 k 是计算色谱柱分离效能的重要参数！18 （四）阻滞因素(迁移率)指在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。小于1 Rf=溶质的移动速度/流动相的移动速度 Rf=溶质的移动距离/溶剂前沿（纸层析）相对迁移率：指在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。19（五）检测方法

9、目标：灵敏度，线性度，重现性，可在线操作在线检测方法： （P180表8-2） 吸光度、化学发光、电化学、电导率、荧光、红外吸收光谱、折射率、质谱等。20二、 色谱的理论基础色谱峰的特征值色谱的定性和定量分析塔板理论和速率理论21（一） 色谱图的特征值221. 基线 当色谱柱没有组分进入检测器时，在实验操作条件下，反映检测器系统噪声随时间变化的线称为基线。它的平直与否可反应出实验条件的稳定情况。稳定的基线是一条直线。 基线漂移：指基线随时间定向的缓慢变化。 基线噪声：指各种噪声所引起的基线起伏（波动）。23 2、峰高（h）和峰面积 色谱峰顶点与基线的距离叫峰高。 色谱峰与峰底基线所围成区域的面积

10、叫峰面积。 峰高和峰面积的大小反映组分浓度的大小。243. 保留值 保留值是用来表示试样中各组分在色谱柱中滞留时间的数值。通常用时间或用组分流出色谱柱所需流动相的体积来表示。a. 死时间(t0) ：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据 t0 可求出流动相平均流速 。25b. 保留时间tr：试样从进样到出现峰极大值时的时间。它包括组份随流动相通过柱子的时间t0和组份在固定相中滞留的时间。c. 调整保留时间tr ：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即：tr =

11、tr- t0由于保留时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。 26d. 死体积V0 指色谱柱在填充后柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相可以忽略不计时死体积可由死时间与色谱柱出口的载气体积流速F0(mLmin-1)来计算。 V0 = t0 Fc0Fco为柱出口的流动相流速（mL/min)，其值为：F0-检测器出口流速；Tr-室温；Tc-柱温；p0-大气压；pw-室温时水蒸汽压。27e.保留体积Vr：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。 f.调整保留体积 Vr：某组份的保留

12、体积扣除死体积后的体积。Vr28g.相对保留值r2,1：组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比。注意：r2,1只与柱温和固定相性质有关，而与柱内径、柱长L、填充情况及流动相流速无关，因此， r2,1在色谱分析，尤其是GC分析中广泛用于定性的依据！ 具体做法：固定一个色谱峰为标准s，然后再求其它峰 i 对标准峰的相对保留值，此时以 表示： 又称选择因子。表示固定相对这两种组分的选择性。表示固定相（色谱柱）的选择性。 r21值越大，分离也越好。 r21=1时，两组分不能被分离。29图11-2 色谱流出曲线图hh1/2YY1/20.607hh. 区域宽度： 色谱峰区域宽度是色谱流出曲线中的一个重

13、要参数。可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。230 标准偏差 即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半 峰底宽度Y 自色谱峰侧的转折点所作切线在基线上的截距，如图所示。它与标准差的关系为 Y=4 半峰宽度Y1/2 又称半宽度或区域宽度，即二分之一峰高处对应的峰 宽度，它与标准偏差的关系为 31（二）色谱的定性和定量分析色谱流出曲线的意义： 色谱峰数样品中单组份的最少个数； 色谱保留值定性依据； 色谱峰高或面积定量依据； 色谱保留值或区域宽度色谱柱分离效能评价指标； 色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。32四种典型情况 分离效果差，

14、柱效低，选择性（）低 完全分离，柱效高，峰窄，选择性（）低 ； 完全分离，选择性（）增加，柱效低，峰宽 完全分离，柱效高，选择性（）好1、对色谱柱分离效果的评价如何评价？峰型，峰间距33 R值越大意味着分离得越好。分离度是柱效能选择性影响的总和，可用其作为色谱柱的总分离性能指标。 用数值来表示分离度（衡量两个组分分离好坏的程度）：有时也用下式表示： 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响： 保留值之差色谱过程的热力学因素； 区域宽度色谱过程的动力学因素，柱效能的高低。Y2Y134R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间 t, minR =0.8：两峰的分离程度可达89%

15、；R =1.0：4 分离，裸露峰面积98%；R =1.5： 6 分离，裸露峰面积达99.7%当R=1.5 时，分离程度99.7%，R=1.5 通常用作相邻两峰是否完全分开的标准。35对于对称峰：当Rs1.0时，两峰总有部分重叠而达到基线分离的分离度Rs 1.5对于不对称的峰形要达到完全分离需要更高的分离度图11-6 A、B混合物的色谱分离图36定性分析的依据： 1.组分在固定床上的位置（内色谱法） 2.组分保留时间或保留体积（外色谱法） 3. 色谱技术与其它光谱技术连用。 气相色谱-质谱检测器（GC-MS） 高效液相色谱-紫外二极管阵列检测器 -红外光谱检测器（HPLC-IR）*虽然保留值与光

16、谱波长精度相比其重现性差些。但是可以通过与标准化合物相比较来定性。2、定性分析(Qualitative Analysis)37 1.用色谱图上的斑点面积定量（内色谱）。 2.用峰高定量 必须保证在改变色谱条件下峰形不变化。另 外，峰高必须与样品的浓度成正比。 可变的条件如柱温，流速和进样体积必须精 确控制。此外，也应避免加样量的超载。 3.用峰面积定量 峰的展宽对定量结果没有影响，常用计算机 辅助积分计算。也可以用手工的方法来近似测量 峰高和半峰宽(h12)。但是如果峰很窄，则测定 的峰面积问题较大。3、定量分析(Quantitative Analysis)38（三）色谱理论试样在色谱中的分离

17、过程的基本理论包括两个方面：1.试样中各组分在两相间的分配情况-热力学过程2.试样中各组分在色谱柱中的运动情况-动力学过程391、塔板理论 引用了处理蒸馏过程的概念、理论和方法来处理色谱分离过程：将连续的色谱过程看作是许多小段平衡过程的重复。塔板理论假定：（1）平衡迅速（2）脉动式进载气，一次一个板体积（ V）（3）试样开始加在零号塔板上，纵向扩散可忽略不计（4）分配系数在塔板上是常数为讨论方便，假设： 塔板数为10, 进样量：1mg, k=1 即p=q。40塔板号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 91mg进样(平衡前)0.5mg(平衡后)0.5mg(平衡前)1V0.5mg0.5mg0.2

18、5mg(平衡后)1V0.25mg0.25mg0.25mg(平衡前)2V0.25mg0.25mg0.25mg0.25mg0.125mg(平衡后)2V0.25mg0.25mg0.125mg0.125mg0.125mg0.125 0.25 0.125 (平衡前)3V0.125 0.25 0.125 (平衡后)3V 0.063 0.187 0.187 0.063 0.063 0.187 0.187 0.063(平衡前)4V 0.063 0.187 0.187 0.063 0.063 0.187 0.187 0.063(平衡后)4V 0.032 0.120 0.187 0.12 0.032 0.032

19、0.120 0.187 0.12 0.032 (平衡前)5V 0.032 0.120 0.187 0.12 0.032 0.032 0.120 0.187 0.12 0.032 (平衡后)5V 0.016 0.076 0.143 0.143 0.076 0.016 0.016 0.076 0.143 0.143 0.076 0.016(平衡前)6V 0.016 0.076 0.143 0.143 0.076 0.016 0.016 0.076 0.143 0.143 0.076 0.016(平衡后)6V 0.008 0.046 0.110 0.143 0.110 0.046 0.008 0.0

20、08 0.046 0.110 0.143 0.110 0.046 0.008(平衡前)7V 0.008 0.046 0.110 0.143 0.110 0.046 0.008 0.008 0.046 0.110 0.143 0.110 0.046 0.008(平衡后)7V0.004 0.027 0.0.078 0.126 0.126 0.078 0.027 0.0040.004 0.027 0.0.078 0.126 0.126 0.078 0.027 0.00441c0为进样浓度，tR 为保留时间， 为标准偏差， c为时间 t时的浓度。 当ttR时，浓度C有极大值，Cmax就是色谱峰的峰高。

21、因此：当实验条件一定时（即一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。当进样量一定时，越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高色谱分析的灵敏度。在理论塔板数n不变的情况下，峰高与保留体积（时间）t成反比。或者说：同一次分析中，同样浓度的不同组分，出峰越晚峰高越小。流出曲线方程42由塔板理论可导出n与色谱峰峰底宽度的关系： 式中色谱柱的长度L，tR及Y1/2或Y用同一单位（时间或距离)1、在色谱柱不变的情况下，即理论塔板数n和长度L都不变的情况下，色谱峰宽度与保留时间t成正比。或者说：同一次分析里，色谱峰的宽度与其保留时间成正比。因此出峰越晚，峰宽越大。2

22、、在色谱柱长度固定的情况下，即保留时间相等的情况下，色谱柱宽度Y与理论塔板数n的平方根成反比。这意味着：在同样长度的不同色谱柱上，理论塔板数n越高，色谱峰越尖锐。通常理论塔板数n即柱效率n。毛细管柱效高，所以色谱峰明显要尖锐的多。H：塔板高度43 考虑到死时间不参与柱内的分配，提出了有效塔板数的概念：1. 色谱峰越窄，塔板数n越多，理论塔板高度就越小，此时柱效能越高，因此n和H可以作为描述柱效能的一个指标。2. n有效和H有效能较为真实地描述柱效能的好坏。 *同一色谱柱对不同物质的柱效能是不一样的。44 通常用塔板高度和塔板数来评估色谱柱的柱效。所以，塔板理论可以近似描述柱内过程的实际情况。塔

23、板理论的成功之处： 解释了流出曲线的形状（呈正态分布） 浓度极大点的位置 计算和评价柱效速率理论塔板理论的不完善之处： 忽略了组分在两相中传质和扩散的动力学过程 分配系数与浓度无关 迅速达到平衡 塔板高度和塔板数受哪些因素的影响 柱效和流速（流动相的线速度）的关系不能很好解释452、速率理论影响柱效的因素 速率方程（也称范弟姆特方程式）: H = A + B/m + Cm H：理论塔板高度，：载气的线速度(cm/s) 减小A、B、C三项可提高柱效； 存在着最佳流速； A、B、C三项各与哪些因素有关？ 1956年荷兰学者范弟姆特（Van Deemter)等提出了色谱过程的动力学理论，他们吸收了塔

24、板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合进去，导出了塔板高度H与载气线速度的关系。涡流扩散项，分子扩散项，传质阻力项46（1） 涡流扩散项A A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径：固定相的填充不均匀因子，空心毛细管柱：A=0 固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。常数A称为涡流扩散(Eddy Diffusion)，当流动相碰到填充物颗粒时，不断的改变流动方向，使试样组分在流动相中形成类似“涡流”的流动，因而引起色谱峰的扩张。47（2）分子扩散项B B = 2 Dg ：弯曲因子，空心毛细管柱， =1，填充柱色谱， 1。

25、 Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2s-1）。 扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差。 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散 扩散系数：Dg （M载气）-1/2 ； M载气，B值试样组分被带入色谱柱后，是以塞子的形式存在与色谱柱的很小一段空间中，在塞子的前后存在着浓差而形成浓度梯度，因此使运动着的分子，发生纵向扩散。B与路径弯曲因子及组分在流动相中的扩散系数D有关。对于气相色谱：48（3）传质阻力项 C 组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL ，液相传质阻力大于气相传质阻力。C =（Cg + CL）49（4）载气流速与柱

26、效-最佳流速 载气流速高时： 传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速，柱效,右图曲线的右边。 载气流速低时： H - u曲线与最佳流速： 流速对柱效的总影响存在着一个最佳流速值 以塔板高度H对应载气流速 作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。 分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速 ，柱效 ，右图曲线的左边。H = A + B/ + C50（5）速率理论的要点(1) 指出了影响柱效的原因：组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间不能瞬间达到分配平衡等因素是造成色谱峰扩展，柱效下降的主要原因。(2) 为色谱条件的选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及

27、分离的影响；选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速，同时要考虑各种因素的相互制约。可变因素 符号 单位 流动相的流速 u cms在流动相中的扩散系数 DM cm2s在固定相中的扩散系数 DS cm2s填料的直径 dp cm液膜的厚度 df cm溶质的脱附速度 td s柱子的直径 dc cm51欲使塔板高度H最小，分离效率最高。需选择以下条件：1、较小的颗粒或较薄的液膜厚度；2、柱床填充均匀致密；3、较小的柱直径；4、在固定相中要有大的扩散系数Ds，在流动相中要有小的扩散DM。 气相色谱分析时可用降低柱温来减小溶质在流动相中的扩散系数。 由于不同大小的分子有不同的扩散系数，峰的扩展也

28、依赖于相对 分子量的大小，小分子的溶质有利于柱效提高。 表 影响峰扩展的各种动力学因素涡流扩散 A纵向扩散 B/u液体固定相中传质项 Cs.u 流动相中传质阻力项 CM.u 52二、色谱法的分类（一）根据固定相基质的形式纸色谱：以滤纸作为基质薄层色谱：将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行色谱过程。柱色谱：将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行色谱分离。53 表11-1 柱色谱法的分类 流 动 相 固定相 色谱法 气 体 固体 GSC(气-固色谱) 液体 GLC(气-液色谱) 液 体 固体 LSC(液-固色谱) 液体 LLC(液-液色谱） 超临界流体 SFC(超临界流体色谱)（二）

29、根据两相所处的状态流动相为气体的称为气相色谱流动相为液体的称为液相色谱54吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。1、吸附色谱以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离的目的。（三）根据分离原理的不同552、分配色谱在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离的目的。相当于连续性的溶剂抽提方法。3、离子交换色谱以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的技术。固定相为离子交换剂，流动相为电解质溶液。564、凝胶过滤色谱（分子筛原理）以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的技术。小分子物质易进入凝胶

30、颗粒内部，流出柱子时间长，大分子不易进入凝胶内部，先流出色谱柱。5、亲和色谱根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力，将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种技术。是分离生物大分子最为有效的色谱技术。57三、色谱系统的操作方法略（P183-P186）58第二节 吸附色谱法一、基本原理固体物质具有吸附能力，可将物质从溶液中吸附到它的表面上。吸附剂从溶液中吸附物质的同时，也有部分被吸附的该物质从吸附剂上脱离（解吸）。被解吸下来的物质向前移动时，遇到前面新的吸附剂会被重新吸附，然后又被后来的洗脱液再次解吸，继续向前移动。经这样反复地吸附-解吸-再吸附-再解吸的

31、过程。物质沿洗脱液的前进方向移动，移动速度取决于吸附剂对该物质的吸附能力。吸附能力强，则向前移动速度慢，反之则快，不同组分便会逐渐分离开。59 二、吸附薄层色谱法将吸附剂均匀地铺在一块玻璃上，形成薄薄的平面涂层，干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少量展开剂的有盖容器中，展开剂接触到吸附剂涂层，借毛细作用向上移动形成薄层色谱，使混合物得以分离。60 （一）基本原理吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，以及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。经过在吸附剂与展开剂之间多次吸附-溶解作用，将混合物中各组分分离成孤立的样点，实现混合物分离。611、固定相选择常用吸附剂（固定相）有硅胶、氧

32、化铝和聚酰胺等。固定相颗粒的大小对展开速度、迁移率、分离效果有显著影响。（二）吸附薄层色谱条件622、展开剂选择主要根据样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度等因素来考虑。先用一种极性较小的溶剂为基础，若展开不好，则用极性较大的溶剂与前一溶剂混合，调整极性，再次实验，直到先出适合的展开剂。633、相对移动值从点样开始到展开后的溶剂前沿。混合物中各组分的移动距离不同。4、显色分离化合物若有颜色，可易识别，无需显色。化合物没有颜色时，要识别点样，使之显色。主要有碘蒸气显色、紫外线显色、喷雾显色。64（三）薄层色谱操作1、制板玻璃板洗净，硅胶调成糊，均匀摊在玻璃上，晾干。用前烘干。2、点样微

33、量进样器在距底边1.5-2.0cm处点样，直径小于3mm。653、展开吹干样点，竖直放入层析缸中。展开剂要接触到吸附剂下沿，但不接触样点。盖上盖子，展开。待展开剂上行到一定高度，取出板，画出展开剂前沿线。4、显色、计算迁移率吹干展开剂，合适方法显色，测量移动距离，计算相对移动值。66三、吸附柱色谱法（一）基本原理在一定条件下，吸附剂与被分离物质之间产生作用，这种作用主要是物理和化学作用。物理作用来自于分子间的范德华力，化学作用主要是氢键作用。67 （二）吸附柱色谱条件1、色谱柱选择通常使用玻璃柱，可直接观察色带移动情况。工业大型色谱柱可用金属制造，在柱壁嵌一条有机玻璃带。682、吸附剂的选择所

34、选吸附剂应有最大的比表面积和足够的吸附能力，对欲分离的不同物质应有不同的溶解和解吸能力。与洗脱剂、溶剂及样品组分不发生化学变化颗粒均匀，操作过程中不破裂。693、洗脱剂的选择洗脱剂纯度较高，不与样品和吸附剂起化学反应。对样品溶解度大，黏度小，易流动，容易与洗脱剂组分分开。70（三）吸附色谱应用主要体现在对生物小分子物质的分离，在生物化学和药学领域有比较广泛的应用。71第三节 分配色谱法一、基本原理分配色谱法是利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间分布情况不同而使混合物得到分离。相当于一种连续性的溶剂提取方法。是把其中一种溶剂固定，用另一种溶剂冲洗。这种分离不经过吸附程序，仅由溶剂提取而

35、完成，因此叫分配色谱法。72固定在柱内的液体称固定相，需一种固体吸附它，此固体只起支撑作用，而不起分离作用。用作冲洗的液体称流动相。流动相与固定相发生接触，样品中各成分在两相间的分布不同，因此移动速度不同。易溶于流动相的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移动慢，依此得到分离。73二、分配色谱条件1、载体的选择惰性的，没有吸附能力的，能容留较大量固定相的物质。主要有硅胶、硅藻土、纤维素等。742、固定相的选择常用的固定相有水、缓冲溶液、酸的水溶液、甲酚胺、丙二醇、有机溶剂等。3、流动相选择一般选用为水所饱和的有机溶剂或水-有机溶剂互溶的混合液。如石油醚、醇类、酮类、苯类等。75三、分配色谱基

36、本操作1、装柱固定相与载体混合后装柱。2、加样被分离物配成浓溶液，加到固定相载体上端；被分离物溶液用含固定相载体吸收，溶剂挥发后，加在载体上端；滤纸吸附被分离物，溶剂挥发后，放在载体上。3、洗脱76四、分配色谱法应用适用于分离极性大，在有机溶剂中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。77第五节 亲和色谱一、亲和色谱概述亲和色谱是利用亲和作用分离纯化生物物质的液相色谱法，它根据生物分子与特定的固定配基之间的亲和力不同而使生物分子得以分离。78二、亲和色谱原理1、原理主要应用生物高分子与配基可逆结合的原理，将配基通过共价键牢固结合于载体上而制得的层析系统。这种可逆结合的作用主要是靠生物高分子对它的配

37、基的空间结构的识别。792、亲和色谱优点高选择性，待分离物质与配基专一性结合，分辨率高。具有浓缩作用，可纯化几千倍，适用于含量极少的活性物质分离操作条件温和，有效保持样品原有的生物学活性，适用于不稳定的活性物质的分离。80三、亲和色谱介质（一）亲和配基1、配基应具备的条件必须具有适当的化学基团以利于固定在载体上配基的分子大小合适，以减小分离过程中的空间位阻效应配基与被分离物质之间有足够大的亲和力，复合物能稳定一定时间配基与被分离物质之间具有合适的特异性（专一性配基与特异性配基）。配基与待分离物之间的结合具有可逆性812、亲和配基的分类按照配基的特性可分为有机小分子类、生物大分子类和染料化合物三

38、类。按照配基的选择性，亲和色谱为配基又可分为专一性配基（仅对某种生物物质具有特别强的亲和性）和基团特异性配基（对某类化学基团或某一类生物分子具有结合作用）两类。823、几类常用的亲和配基（1）抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，因此可利用抗体或抗原为配基分离纯化相应的抗原或抗体，此种亲和色谱法又称免疫亲和色谱。利用免疫亲和色谱法，特别是以单抗为配基的免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。83（2）蛋白质A和蛋白质G，它们与抗体的结构非常相似，可做为各种抗体的亲和配基。蛋白质A来源于金黄色葡萄球菌，蛋白质G分离自G群链球菌，与许多动物的免疫球蛋白的Fc片段具有很强的亲和结合作用

39、。它们与抗体的结合并不影响抗体与抗原的结合，因此它们也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。蛋白质A和蛋白质G与不同种属来源的各种免疫球蛋白的亲和性不一。84A蛋白与抗体、抗原结合的示意图85（3）凝集素外源凝集素是一种天然蛋白质，含有糖结合部位，与一些糖的残基或链段具有高度亲和力，可结合糖基。不同凝集素与糖结合的特异性不同。伴刀豆球蛋白A是常用的亲和配基，可用作糖蛋白、多糖、糖脂、各种含糖配基的生物大分子物质以及整个细胞、细胞表面受体蛋白和细胞膜片段的分离纯化。86（4）酶抑制剂：蛋白酶均存在抑制其活性的物质称酶抑制剂。具有特殊的结构，能够与酶的活性中心结合，从而抑制酶的活性。酶的抑制剂可以作为

40、配基用于酶的分离纯化。87（5）辅酶和磷酸腺苷某些酶需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和配基。主要的辅酶有NAD、NADP、ATP88（6）过度金属离子铜、镍、锌等可与氮、硫、氧等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基发生亲和结合作用。许多蛋白质和肽类分子表面都不同程度地含有暴露的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸，这些氨基酸能与二价金属离子发生螯合作用。因此可利用金属螯合色谱得以分离纯化。89（7）组氨酸具有比较独特的性质，可与蛋白质发生亲和结合作用。在低盐和pH约等

41、于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附最强，随盐浓度的增大，亲和吸附作用降低。根据此特性，利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质。90（8）色素配基三嗪类色素是一类分子内含有三嗪环的合成活性染料，与各种需要在NAD的存在下表现其生物活性的脱氢酶和激酶具有结合作用。这类色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用。利用色素为配基的亲和色谱法一般称作色素亲和色谱。91（9）其它配基肝素：为酸性多糖，具有抗凝血作用。与脂蛋白、脂肪酶、限制性内切酶、甾体受体、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。多聚腺苷酸：用于信使RNA的结合蛋白、病毒RNA、与DN

42、A有关的NRA酶、核酸抗体等生物活性物质的色谱分离。92（二）载体1、载体应具备的条件不溶于水，但具有高度亲水性化学惰性，没有或极少的物理吸附或离子交换等非特异性结合作用。具有多孔网状结构，有利于溶液的流动和渗透。必须具有足够的可同配基结合的化学基团具有良好的化学稳定性具有良好的物理稳定性均匀性好，最好是均匀的球形结构，对不同分离产物具有不同的分离效果932、常用载体琼脂糖凝胶、交联琼脂糖、葡聚糖凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃除此之外，还有一些合成的高分子材料，具有刚性良好，粒度均匀，孔径较大，pH适用范围广等优点。94（三）活化剂载体上的化学基团是不活泼的，不能与配基直接偶联，通过化

43、学反应介质上化学基团处于活化状态。能使载体发生产生自由基与配基结合的化学物质称为活化剂。95四、亲和色谱制备选择合适的配基、载体和间隔臂选择合适的活化剂和活化方法活化载体配基偶联封闭未偶联配基的活化基团9697（一）配基的选择目标产物与配基之间的亲和力的大小和专一性。它们之间的结合常数应在104-108mol/l之间.如果配基与生物分子之间的结合作用过强，需要强烈的洗脱条件才能将给合物洗脱，容易导致蛋白质变性。98（二）载体的选择应具有高的比表面积，亲水凝胶较为适合做亲和色谱的载体。不同的载体适合分离不同的生物分子。99（三）载体偶联1、偶联条件的选择pH缓冲液温度和时间配基浓度1002、偶联

44、反应（1） 溴化腈法用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）对多糖类载体的活化在碱性（pH10）条件下数分钟即可完成，之后的配基修饰亦需在碱性条件进行，一般使用碳酸盐缓冲液。反应过程为： 101 （2） 环氧基活化法可用于固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH的配基。常用的活化试剂为1,4-丁二醇-二缩水甘油醚（BGE）和环氧氯丙烷。以活化羟基为例：或引入活性基团环氧基后，可采用直接法或间接法（氧化法、碳二亚胺法、戊二醛法）固定配基。 102 （3）硅胶的活化活化硅胶常采用硅烷化试剂，如-氨丙基三甲（乙）氧硅烷和环氧丙基三甲基硅烷等，反应为：引入活性

45、氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基可发生二醇化反应：103（4）碳二亚胺交联法（P217图8-15）将氨基类配基偶联到具有羧基末端的间隔臂或载体上，或将羧基类配基偶联到具有氨基端的间隔臂或载体上。104（5）有机磺酰氯法（P217图8-16）将含氨基和巯基的配基偶联到琼脂糖上。105（四）间隔臂当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效的亲和吸附作用。 这时，需要在配基 与载体之间连接一 个“间隔臂”，使其发 生有效的亲和结合。间隔臂的作用106间隔臂应满足以下条件：发生作用的活性位点必须位于配基分子的内部，并且不能影响配基与目标产物结合；长度适当，不能过短，否则难以和配基有效结合，不能太长，以免自身某些基团发生相互作用，同时结合能力下降；必须在某种特定的分离条件下能被洗脱107（五）封闭活化结束后有少部分活化基团未被配基偶联，需要将其封闭。可加入过量的能与活化剂反应的试剂封闭多余的活化基团，或水解活化基团。108（六）亲和色谱介质的技术指标配基偶联量：适于小分子质量配基样品吸附量：适用于大分子质量配基化学稳定性：抗氧化能力，配基不