草莓未受精子房的离体培养

1、草莓未受精子房的离体培养论文导读:：在细胞全能性学说的根底上，以草莓为试材，MS为根本培养基，研究不同的离体培养条件下诱导草莓未受精子房雌核发育的情况，寻求高频率诱导草莓雌核发育的条件。本研究采用单因子比拟实验法，分析比拟了不同基因型、外源激素种类和浓度、蔗糖浓度、低温预处理的时间、生长环境及发育状况、温度和光照条件六个关键因素对诱导草莓雌核发育的影响。试验结果说明：选择适宜的基因型的露地栽培苗的一级花蕾，4低温预处理48h，接种于含6%蔗糖和0.8%琼脂的MS根本培养基中附加2.0 mg/L的外源激素 2,4-D的诱导培养基上，在每12h变温(2516) 且连续黑暗的条件下培养最容易诱导草莓

2、未受精子房雌核发育获得单倍体胚囊植株。本研究为草莓倍性育种提供参考。论文关键词：草莓，未受精子房，雌核发育，离体培养未受精子房或胚珠离体培养是人工诱导形成单倍体植株的技术之一。与花药培养相比，经未受精子房或胚珠离体培养诱导的单倍体植株至少有四个独特的优点：(1)有些植物花药培养至今难以成功或诱导率太低，而未受精子房或胚珠离体培养可提供一条单倍体育种新途径：(2)对于雄性不育的植物无法用花药来培养获得单倍体，可采用未受精子房或胚珠培养来诱导；(3)未受精子房或胚珠培养的后代能产生较多的绿苗【1】；(4)培养地方品种或杂种一代的未受精胚珠或子房，可迅速获得高纯度种质资源，在高效率利用种质资源、提高

3、选育效果方面有理论研究和实际应用价值。近年来国内外学者在此方面做了许多探索性工作，到目前为止相继有25种，2变种植物通过未受精胚珠或子房的离体培养，获得了单倍体植株。但在果树中至今没有未受精子房或胚珠离体培养的报道【2】。草莓是蔷薇科草莓属(Fragaria)多年生草本雌核发育，是世界许多国家广泛栽培的一种浆果类植物。上世纪60年代以来草莓的离体培养研究和应用颇受重视，各种器官、组织和细胞的培养迅速开展，开展了包括茎尖培养、花药培养、抗性体细胞无性系筛选、基因转化等方面的研究，并取得了一定的进展。1998年Ahokas用秋水仙素、二甲基亚砜、甘油处理二倍体和四倍体草莓体内诱导产生单倍体【5】，

4、但是草莓未受精子房离体培养诱导雌核发育的研究至今未见报道。1 材料和方法1.1 试验材料供试材料由沈阳农业大学园艺系草莓资源圃提供。取不同基因型草莓开花前2d花药未裂开的一级或二级花蕾作外植体，并置4冰箱低温预处理不同时间备用免费。1.2 试验方法试验准备：配制MS培养基 Percen-tage 个 Number Percen-tage 有胚 With embryo 无胚 Without embryo 丰香Fenxiang 8X 37 6 16.2 12 32.4 6 14 16.2 明旭Mingxu 8X 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 实生Shisheng

5、 8X 32 4 12.5 22 68.8 5 5 15.6 J10 8X 19 1 5.3 18 94.7 2 0 10.5 天津5号 TianjinNO5 8X 18 4 22.2 14 77.8 13 1 72.2 哈尼Hani 8X 55 0 0 17 30.9 0 0 0 弗州草莓 F.virginiana 8X 145 0 0 69 47.6 0 0 0 UC10 8X 34 2 5.9 0 0 5 0 14.7 EMC 2X 10 2 20.0 0 0 7 0 70.0 -3号Xinjiang NO.3 2X 68 0 0 0 0 0 0 0 The effect ofdiffe

6、rent genotype on the induction in vitro of unfertilized ovary instrawberrytable12.2 外植体的生长环境及发育状况对草莓未受精于房离体诱导的影响从表2中可知，露地材料诱导结种率明显高于保护地材料，而且一级花蕾诱导效果又明显优于二级花蕾。表2 外植体不同生长环境及发育状况对草莓未受精子房离体诱导的影响Table 2 The effect of explant under thesituation of different growth environment and development status on the

7、induction in vitro of unfertilized ovary in strawberry 外植体 Explants 接种的花托数 Inoculating receptaole number 子房膨大花托数 Receptacle with inflated ovary 具愈伤组织花托数 Receptacle with callus 种子数 Seeds(number) 结种率 ( Spermideus rate 个Number () Percenage 个 Number () Percentage 有胚 With embryo 无胚 Without embryo 露地苗一级花蕾

8、 The first grade buds of outdoor plants 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 保护地一级花蕾 The first grade buds of greenhouse plants 90 8 8.9 17 18.9 11 5 12.2 露地苗二级花蕾 The second grade buds of outdoor plants 28 6 21.4 4 14.3 7 3 25.0 保地苗二级花蕾 The second grade buds of greenhouse plants 34 2 5.9 9 26.5 2 4 5.9 2

9、.3 低温预处理对草莓未受精子房离体诱导的影响接种前外植体在4条件下低温预处理，实验说明对诱导草莓未受精子房产生有胚种子;的效果是非常明显的。从表3中可知，在低温处理一定时间内，诱导效果随处理时间的增长而提高，处理48h对诱导结种率最适宜，时间再长那么诱导结种率缓慢下降。表3不同低温预处理时间对草莓未受精子房离体诱导的影响Table 3 The effect of different time after cold-pretreatment on theinduction in vitro of unfertilized ovary in strawberry. 处理时间 Time of co

10、ld- Pretreatment (h) 接种的花托数 Inoculating receptaole number 子房膨大花托数 Receptacle with inflated ovary 具愈伤组织花托数 Receptacle with callus 种子数 Seeds(number) 结种率 () Spermi- dues rate 个 Number () Percentage 个 Number () Percentage 有胚 With embryo 无胚 Without embryo 0 51 3 5.9 27 52.9 3 10 5.9 12 24 82 64 11 22 13.

11、4 34.4 64 24 78.1 37.5 16 14 12 13 19.5 21.9 48 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 60 73 17 23.3 24 32.9 18 14 24.6 72 31 8 25.8 0 0 7 8 22.6 24 外源激素对草莓未受精子房离体诱导的影响从表4统计结果分析得知，不加外源激素不能诱导子房的膨大和雌核发育；生长素类物质2，4-D是诱导雌核发育并产生种子;所必需的；单独添加2，4-D可诱导产生有胚的种子;；添加细胞分裂素类物质BA和KT抑制了子房的膨大，并不同程度地促进了花托体细胞愈伤组织的形成免费。表4外源激素对

12、草莓未受精子房离体诱导的影响Table 4 Effects ofextrinsic hormone on the induction in vitro of unfertilized ovary in strawberry 激素种类及浓度 The kind and concentr-ation of hormone 接种的花托数 Inoculating receptacle number 子房膨大花托数 Receptacle with inflated ovary 具愈伤组织花托数 Receptacle with callus 种子数 Seeds(number) 结种率 Spermi-deus

13、 rate 个 Number (%) Percen-tage 个 Number (%) Percen-tage 有胚 With enbryo 无胚 Without enbryo 无激素 16 0 0 0 0 0 0 2.4-D0.5 8 3 37.5 0 0 0 9.7 2.4-D1.0 41 3 7.3 16 39.0 4 13.6 2.4-D1.5 22 3 13.6 9 40.9 3 29.7 2.4-D2.0 590 72 12.2 251 42.5 175 12.4 2.4-D2.5 32 3 9.4 17 53.1 4 0 2.4-D1.0+BA0.5 20 0 0 14 70.0

14、 0 0 2.4-D1.0+BA0.5+ NAA1.0 48 1 2.1 45 93.7 0 0 2.4-D1.0+BA0.5+ NAA1.0+KT0.5 83 0 0 65 78.3 0 0 2.4-D1.0+BA0.5+NAA1.0+KT1.0 132 3 2.3 104 78.8 0 0 2.4-D1.0+BA0.5+NAA1.0+KT0.5 76 0 0 33 43.4 0 0 2.4-D1.5+BA1.0+NAA0.5 112 0 0 54 48.2 0 0 2.4-D1.0+ NAA1.0+KT1.0 164 3 1.8 94 57.3 0 0 从图1中更直接地反映出，当2,4-D

15、浓度小于2.0mg/L时，诱导结种率随2,4-D浓度的增大而增高，2.0mg/L2,4-D的浓度在所研究的激素组合中诱导效果最好，结种率达29.7，当2,4-D浓度为2.5mg/L时，那么诱导率明显下降。图1 不同2,4-D浓度对诱导未受精草莓子房结种率的影响Fig1 Theeffect of different 2,4-D concentration on the spermideus rate of inducedunfertilized ovary in strawberry2.5 蔗糖浓度对草莓未受精子房离体诱导的影响从表5和图2分析发现：随着蔗糖浓度的升高体细胞愈伤组织的形成明显受到

16、抑制；子房膨大率、结种率在蔗糖浓度低于6时雌核发育，随蔗糖浓度的升高而增大；当蔗糖浓度高于6后，二者那么降低；在6的蔗糖浓度时子房膨大率、结种率均为最大，分别达12.2和29.7。 蔗糖浓度() Sucrose Concent-ration 接种的 花托数 lnoculating receptacle number 子房膨大花托数 Receptacle with Inflated ovary 具愈伤组织花托数 Receptaole with callus 种子数 Seeds(number) 结种率 () Spermideus rate 个Number () Percen- tage 个 Num

17、ber () Percen- tage 有胚 With embryo 无胚 Without embryo 0 79 2 2.5 62 78.5 6 5 7.6 2 41 1 9.1 29 70.7 6 4 14.6 4 71 8 11.3 33 46.5 10 5 14.1 6 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 8 65 1 1.5 19 29.2 1 1 1.5 10 384 2 0.5 49 12.8 3 2 0.8 表5蔗糖浓度对草莓未受精子房离体诱导的影响Table5 Theeffect of sucrose concentration on the i

18、nduction in vitro ofunfertilized ovary in strawberry图2 不同蔗糖浓度对诱导草莓未受精子房发育的影响Fig2 Theeffect of different sucrose concentration on the induction ofunfertilized ovary in strwberry2.6温度和光照对草莓未受精子房离体诱导的影响本实验就温度和光照对诱导效果的影响进行了研究，表6说明前期黑暗培养优于光照培养，变温培养又优于恒温培养，总结果是：变温黑暗变温光照黑暗交替恒温黑暗变温光照恒温光照。表6 培养条件对诱导效果的影响 培养条

19、件 Culture condition 接种的花托数 Inoculating receptaole number 子房膨大花托数 Receptacle with inflated ovary 具愈伤组织花托数 Receptacle with callus 种子数 Seeds(number) 结种率 () Spermi-deus rate 个 Number () Percen-tage 个 Number () Percen-tage 有胚 With embryo 无胚 Without embryo 25恒温连续光照 Constant temperature at 25,light 70 3 4.

20、3 38 54.3 4 6 5.7 25C恒温连续黑暗 Constant temperature at 25，darkness 83 12 14.4 30 36.2 15 7 18.1 2516C变温连续光照 Alternative temperature at2516,light 68 4 5.9 40 58.8 6 7 8.8 25C16变温连续黑暗 Alternative temperature at2516,darkness 590 72 12.2 251 42.5 175 68 29.7 2516变温、光照黑暗交替 Alternative culture condition at 2

21、5 light16 dorkness 54 9 16.7 18 33.3 14 10 25.9 The effectof culture condition on the induction resulttable63讨论离体诱导非洲菊未授粉胚珠形成愈伤组织的8个品种中诱导率不同 【6】。水稻未受精子房培养中，胚囊愈伤组织的诱导频率依野生稻、籼稻、粳稻的次序增加【7】。目前还有玉米Zea mays L.、甜菜Beta vulgaris L.、洋葱Allium cepaL.、小麦Triticumsativum Lam.、向日葵Helianthus annuus L.等植物子房培养再生单倍体植株具

22、有基因型依赖性。可见，不同基因型的同种植物单倍体的诱导率变化很大，选择适宜的基因型对诱导雌核发育是很重要的。本研究证实草莓离体培养再生单倍体植株同样具有基因型依赖性。基因型相同但生长环境及发育状况不同诱导雌核发育的效果也不同。试验中草莓春季露地苗比冬季保护地苗诱导率高，一级花蕾比二级花蕾诱导率高。文献报道水稻Oryza.sativa L.的雌核发育主穗比分蘖穗易诱导。刘栓桃等分别用9种基因型的西葫芦(Cucurbita pepo L.)开花前一天、开花当天以及开花后一天的未受精胚珠为外植体，研究了不同取样时期对再生植株产率的影响，结果其中8种基因型均以开花当天的胚珠最适合诱导培养，再生植株产率

23、最高。试验中露地材料诱导结种率明显高于保护地材料。对于玉米，温室中春季生长的植株有利于雌核发育，非洲菊中秋季的材料比春季的愈伤组织诱导频率高，而春季材料诱导的愈伤组织比秋季的易分化。上述材料均说明选择处于较优越的生长条件抗性好的供体材料对雌核发育有利。用子房或胚珠诱导雌核发育外植体是否低温预处理，文献不尽相同。早在1981年周嫦和杨弘远在对水稻幼花接种后先在1214冰箱中放置6天，然后再培养可起到促进的效果。在对向日葵的研究中说明雌核发育，接种前进行24h或48h低温预处理(24)，孤雌生殖诱导率有所提高，而珠被愈伤组织那么受到明显抑制。本试验也表现为4低温预处理48h最正确免费。然而在西葫芦

24、(Cucurbita pepoL)的研究中，发现不经低温处理的子房诱导单倍体植株的比率高。大多数成功的实验都采用了外源激素诱导雌核发育，且不同植物需要不同的激素和浓度，如百合、西葫芦。在本试验中，当2,4-D浓度小于2.0mg/L时，诱导效果和2,4-D浓度呈正相关，添加细胞分裂素类物质BA和KT使激素总水平较高，那么抑制了子房的膨大，并不同程度地促进了花托体细胞愈伤组织的形成。使未受精子房或胚珠成功诱导出单倍体植株的培养基中都添加了一定浓度的蔗糖，但不同的植物培养要求的最适蔗糖浓度是不同的，如杨树培养的适宜浓度为10，非洲菊培养1效果最正确，烟草在蔗糖浓度为0.40gL时，胚状体诱导率较高。

25、多数植物由于缺乏严格的比拟实验，尚难掌握其最适浓度，在本试验中比拟了0%、2%、4%、6%、8%、10%的蔗糖浓度，最终确定最适浓度是6%雌核发育，浓度过高或过低均不利。这一研究结果和闫华等研究蔗糖浓度对向日葵离体孤雌生殖和体细胞增生的调节作用的趋势相似。诱导雌核发育的不同阶段，除改变培养基组成外，采用不同的培养温度和光照条件，雌核发育的诱导率也会有较大的差异。杨树子房光照培养比黑暗培养时体细胞愈伤组织较少，雌核发育也较快。黑暗条件是水稻雌核发育、胚状体形成的有利条件 ，但豌豆再生植株和甜菜再生植株必须光照培养。到目前为止，在进行未受精子房诱导雌核发育时在培养温度和光照方面缺乏比照试验，许多植

26、物不能确定最适的培养温度和光照条件。文中进行了5组比拟试验，确定了草莓未受精子房离体培养诱导雌核发育的最适光照和温度条件是每12h变温(2516)黑暗培养。植物未受精子房或胚珠离体培养诱导雌核发育产生单倍体的过程十分复杂，但其理论和实际意义重大，值得深入研究。References【1】LIU Yong-sheng.Plant cultivationtechnique in the embryo of horticultural plants. Journal of HenanVocation-technical Teachers College,1990,18(2):32-36.【2】WANG

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