线粒体功能障碍与人体疾病的研究进展

1、文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持兰州交通大学化学与生物工程学院综合能力训练I 文献综述题目：线粒体疾病的最新研究进展作者：朱刚刚学号：0指导教师：谢放完成日期：2014-7-16线粒体疾病的最新研究进展摘要：本文为了对线粒体疾病研究的最新进展进行论述，分别从线粒体功能障 碍、线粒体疾病、以及相关线粒体疾病的治疗与干预策略三个方面进行了综述。 重点从线粒体的功能障碍进行了介绍。关键词：线粒体、线粒体tDNA、线粒体疾病。引言：线粒体疾病主要是指由于线粒体 DNA突变所导致的一类疾病。有许多人类疾病的发生与线粒体功能缺陷相关，如线粒体肌病和脑肌病、线粒体 眼病,老年性痴

2、呆、帕金森病、O型糖尿病、心肌病及衰老等，有人统称为线粒体 疾病。线粒体疾病的发生被认为与氧化磷酸化过程相关基因的突变有关。一、线粒体功能障碍1线粒体结构、基因组特征及主要功能线粒体结构及基因组特征电镜下的线粒体是由两层单位膜套叠而成的封闭囊状结构，从外向内依次分为外膜、膜间隙、内膜、基质。不同于经典 的“隔舱板”理论，最新提出的三维重构模型认为：外膜与内质网或细胞骨架 连接形成网络；（2）内外膜间随机分布横跨两端，宽20nm的接触点；（3）内膜通 过界面与崎膜接口部分相连，并不直接向内延伸形成崎膜；（4）崎膜非“隔舱板”式而是管状或扁平状，相互间可连接或融合，呈现不同的形式。执行线粒体功能文

3、档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持.的生物大分子分布在不同的空间：外膜上有Bcl-2家族蛋白、膜孔蛋白以及离子通道蛋白；内膜中有电子传递链(呼吸链)复合物IIV和复合物V(ATP合成酶)； 膜间隙和崎膜腔分布着细胞色素 C、凋亡诱导因子(apoptosis in-ducing factor , AIF)和Procaspase 2、3、9及其他酶蛋白；电压依赖性阴离子通道 (VDAC)、 ADP/ATP 转换蛋白(ANT)和线粒体膜转运孔(mitochondrialper-meabletransition pore, MPTP)存在于接触点；三竣酸循环(TCA cycle

4、)酶系、存储钙离子的致密颗 粒及线粒体基因组则包含于基质中。【1】与核基因组(nDNA)不同，mtDNA结构简单，仅含16 569个碱基，编码2种rRNA、22种tRNA和13种参与呼吸链 形成的多肽。通常裸露且不含内含子，既缺乏组蛋白保护和完善的自我修复系统， 又靠近内膜呼吸链，极易受环境影响，突变频率比nDNA高1020倍。线粒体功能作为糖、脂肪、氨基酸最终氧化释能的场所，线粒体的主要功能是进行氧化磷酸化、合成 ATP,为生命活动提供直接能量。除此以外，它 还扮演着多种角色，其中之一是充当“钙库”，参与细胞内钙离子的信号传导。 研究发现，一旦感受到周围形成的钙微区(calciummicro

5、domain),线粒体可以利 用呼吸代谢时产生的电化学梯度，通过膜上协同转运体将钙摄入基质，然后以磷 酸钙的形式储存在一些较大的致密颗粒中。121已经积累的Ca2+又可以通过钠钙交换系统(2Na+/Ca2+exchanger , NCE)和大分子MPTP转运孔道再次释放 到胞质，从而调节胞浆中钙离子的动态平衡，影响细胞内许多相关的生理活动， 如信号传导、能量代谢和细胞凋亡。线粒体参与了细胞凋亡。研究发现，在典型 的凋亡特征，如染色质浓缩、D N A碎片(D N Aladder)、凋亡小体等出现以前， 线粒体已经发生跨膜电位丧失、外膜通透性增加、膜间隙蛋白释放等重大变化。细胞色素C是诱发凋亡的重

6、要信号分子，它是相对分子量为1.45 x104Da的水溶性蛋白，一般分散在膜间隙靠近内膜面，不能通过外膜。凋亡发生时释放到胞 质，在 ATP/dATP 的参与下，与 Apaf-1(apoptoticproteaseactivatingfactors) 结 合形成寡聚体(Apoptosome) , Apaf-1再通过其氨基端与Caspase-9的功能前端 相互作用，导致Caspase-3活化并进一步激活下游的 Caspases。止匕外，还有一 种不依赖于 Caspase的凋亡诱导因子(AIF),是分子量为5.7 x104Da的黄素蛋 白，与细菌铁氧还原蛋白和 N A D H氧化还原酶有高度同源性

7、，释放后可直接 到达细胞核，激活核酸内切酶，引发凋亡。【3】目前认为，Bcl-2家族蛋白的调控与MPTP孔道的开放，是造成外膜非特异性断裂、通透性增高、凋亡因子释 放的主要原因，而氧自由基积聚、氧化应激产生，可能直接参与并诱导了的下降 和MPTP的开启，是构成凋亡信号传导的早期事件。线粒体既是自由基的攻击 靶点，也是自由基的产生源头。胞内95%以上的活性氧(reactive oxygenspecies ,文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持ROS）来自线粒体氧化磷酸化，是分子氧接收呼吸链“漏电子”后还原形成的副 产物，包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢。它们中20%来自

8、复合体I, 80%来自复合体III ,大致占呼吸态IV总耗氧量的2%6% ,极易诱发氧化应激， 造成细胞损伤。不过，由于具有完善的抗氧化防御体系，细胞内多余的 ROS总 能及时被清除。已知的抗氧化系统分为酶性和非酶性两种，包括超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（Catalase）以及谷胱甘肽 （GSH）、抗坏血酸、亲水性（疏水性）抗氧化物质等。正是依赖这样的防御措施， 体内自由基的。2、线粒体 DNA（mtDNA） 缺陷线粒体DNA（mtDNA）缺陷、氧化磷酸化异常及能量代谢障碍，通常能引起细 胞结构、功能发生一系列渐进性，甚至不可逆性的病理改变，在脑组

9、织中影响尤 为明显，因为大脑虽然重量仅占身体总重的 2%,但对氧的消耗量却要占到身体 总消耗量的25%哺乳动物 mt tRNA有3种常见的非典型二级结构（Fig. 1） 绝大多数tRNA具有高度保守的三叶草结构（Fig. 1 A, 0型）【5】.在环和 螺旋线平面间的一些相互作用下形成tRNA的三级结构即L折叠，比如TWC环（T环）和二氢尿喀呢环（D环）.1980年mtDNA测序发现，人类和牛科 动物 mt t R NASer（ AGY）（ Y = U 和C）没有完整的 D环结构（Fig . 1D, III 型）.生化研究发现，mt t R NASer（ AGY）能氨酰化，而且在体外具有翻译活

10、 性.进一步的晶体结构分析发现，其核心结构区的弹性比0型结构大.在核糖体上，反密码子环和 3CCA末端之间存在约78度的类飞镖结构；由于D 环的G18和G19以及T环的U55和C56均不保守，导致II型tRNA缺 乏典型的D环和T环间的相互作用（Fig. 1C, II型）.对tRNAPhe和mt tRNAAsp的化学检测发现，D环和T环间相互作用微弱，但在 D茎存在典型 的三级作用，形成稳定的核心；对mt t RNA结构进行深入研究发现。tRNASer（ UCN）同样具有不典型的三叶草结构（Fig. 1B, I型）.其结构 特征如下：接受臂和D环间只有个腺甘酸；D环缩短；额外多1个环.化学 检

11、测和电脑模拟结果显示，D环或其它环核心区的多个缺失能通过增加反密码 子螺旋区的碱基对（27a43a）来弥补，从而维持类 L型的结构mtDNA处于 氧自由基的包围之中，缺乏组蛋白的保护，由于线粒体缺乏DNA损伤修复系统， 突变率是核DNA的1020倍.选择压力在核基因中淘汰了许多突变，而 在线粒体中这种压力被松弛，由线粒体编码的蛋白质和RNA突变后，对个体的适应性比核编码的高.【7】由此造成哺乳动物mtDNA进化速率增快（约为核 DNA的510倍），可能是 mttRNA序列和结构多态性的主要原因之一.文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持mt DNA 译码系统遗传密码几乎是

12、通用的，但是有极少数的例外.哺乳动物线粒体AUA、UGA、AGR （ R = A和G）分别翻译为 Met、Trp和终止密码子（这与通常的译码不 同，Table 1）.多数已鉴定的密码变化发生在线粒体中，而密码的改变会对细 胞蛋白质发生致命性的影响，由于线粒体有自己的tRNA,密码的改变不影响细 胞基因组.【8】相反，在线粒体中，这种改变可以看做是一种基因组的精简.最初的译码准则是密码子第 3位的U只能被A和G识别，然而U34的构象 灵活多变，它与4种碱基都能配对（Crick称其为变偶性）.无修饰的U通过 变偶配对降低了人类 mt t RNA的种类（Table 1）.仅22种mt t RNA即可

13、 翻译60个有意义的密码子，这也是翻译有意义的密码子最少的一组tRNA.终止因子 mt RF1a识别终止密码子 UAA和UAG. mRNA CO1和ND6的终 止密码子分别是AGA和AGG.因为两者都没有相应的tRNA和释放因子， 长期以来AGR 一直作为它们的终止密码子，但这个机制并不清楚. 近年发现， 哺乳动物mt RFIa通过在AGR密码子后移一个读码框架来识别终止密码子。【9】二、线粒体疾病。1、线粒体疾病的分类线粒体疾病主要分为两大类：遗传性和获得性疾病，前者病因包括核DNA损害、线 粒体DNA损害和基因组间的通讯障碍，后者主要由毒素、药物和衰老引起。目前 的主要研究集中于线粒体DN

14、A突变与线粒体疾病临床表型的相互关系上。目前 人们所认识的线粒体疾病主要是一些神经肌肉变性疾病，如Leber s遗传性视神 经病,线粒体脑肌病，帕金森氏病，阿尔茨海默病，母系遗传的糖尿病和耳聋等。根 据mtDNA突变的性质可以将其分为两种主要类型，即碱基替换突变和插入一缺 失突变。碱基替换发生的位置不同，引起的突变效果也不同。发生在白质基因上 的碱基替换可以导致错义突变，进而影响蛋白质的功能。发生在tRNA和rRNA基 因上的碱基替换可以影响tRNA和rRNA的结构，导致蛋白质合成障碍。10缺失一 插入突变是指mtDNA在复制分离过程中发生了碱基序列的丢失或插入，其中以 缺失突变较为常见。大片

15、段的缺失多发生在两个同向重复序列之间。最常见的缺 失突变是4977bp缺失,约50%的4977bp缺失发生在847013447区域两个 13bp的同向重复序列（5-AC-CTCCCTCACC呼问。还有一较为常见的缺失是 7436bp缺失，常发生在863716073区域两个12bp的同向重复序列。1111 （5-CATCAA-CAACCG之间。大片段的缺失往往涉及多个基因，最终导致线粒体 OXPHOS功能下降，产生的ATP减少，从而影响组织器官的功能。mtDNA突变导文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持致的OXPHOS缺陷的严重性是由突变 mtDNA的性质及其在细胞中所占

16、的比例决 定的,而突变mtDNA的表型又与OX-PHOS缺陷的严重性及各个组织器官的能量 阈值有关。中枢神经系统及肌肉组织对 ATP的需求量大，因此最易受累，其它象心 脏、肾脏、肝脏以及胰岛组织对 OXPHOS缺陷也较敏感，故也常常出现这些组织 器官的变性疾病。11212.线粒体脑肌病ME是一组由于线粒体功能缺陷造成的以神经肌肉系统病变为主的多系统疾病。根据临床表现可分为伴有破碎红纤维的肌阵挛癫痫（MERRF）,伴高乳酸血症中风样发作的线粒全脑肌病（MELAS）, Kearns-sayre综合征（KSS）,慢性进行性眼外肌 瘫痪（CPEO）神经源性肌软弱病、共济失调并发色素性视网膜炎 （NAP

17、P）等。（1） MERRF MERRF是一种母系遗传病，主要表现为阵发性癫痫、骨骼肌不自主痉挛 伴破碎性红肌纤维病、全身性抽搐和小脑共济失调等。【 通常在1020岁发 病，晚期可出现精神异常。1988年Wallace等7发现MERRF患者神经症状严重 程度和呼吸链中NADH脱氢酶、细胞色素C氧化酶活性降低程度均与 OXPHOS 缺陷相关，后来发现MERRF家系中存在一个mtDNA的8344A-G的碱基置换， 该突变位于mtDNA的tRNAlys基因上，涉及到tRNAlys的TUC环，此环参与tRNA 与核糖体的连接，结果影响线粒体蛋白质的合成（主要是影响OX-PHOS复合体I 和IV的合成），

18、造成OXPHOS的功能下降，最终导致MERRF的多系统病变。【13】8344 点突变产生了一个新的 CviJ I酶切位点，可用于此病的诊断。（2） MELAS MELAS 是一种不常见的母系遗传病，通常在1020岁发病，主要临床表现为中风样发作、 血乳酸中毒、近心端四肢乏力、间断性呕吐等。1151 1990年Goto等首次发现了 MELAS患者中普遍存在有 mtDNA3243A fG突变，目前认为3243AfG突变是 MELAS的主要致病因素。该突变使tRNAleu基因发生突变，导致16SrRNA的合成 减少，最终影响线粒体内蛋白质的合成。其它与之有关的突变有mtD-NA11084AfG突变和

19、3771突变。Salvatore等报道，在血液中突变的比肌肉组织少，且在某 些病例的血液中未发现有 mtDNA突变,提示在MELAS突变检测血细胞是可行的， 但不是绝对可靠的诊断依据。（3） KSS和CPEO临床上以眼外肌麻痹伴有四肢 乏力为主要症状者称为CPEQ当伴有色素性视网膜炎、听力丧失、心脏传导功 能障。1161三、相关线粒体疾病的治疗与干预策略1、线粒体疾病是指线粒体基因组和核基因组突变导致氧化磷酸化功能缺陷而引起的疾病。文档来源为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持异质性mtDNA突变致病的阈值水平相对较高，大多在80%90%，所以只要降 低受累组织的突变负荷就可以达

20、到治疗效果即通过将突变型 mtDNA转变成野 生型mtDNA 0这样不仅使突变的 mtDNA比率选择性地下降，而且野生型 mtDNA的比率也可以升高。1171线粒体靶向限制性内切酶改变突变异质性限制 性内切酶(restriction enzyme, RE) 能在特异性限制位点选择性地剪切 DNA双 链。某些mtDNA突变会产生一个新的限制性酶切位点，线粒体靶向RE可以识别这个位点，并对突变的 mtDNA进行降解，使得剩余的野生型 mtDNA比率 相对升高，从而降低细胞中突变 mtDNA的比例，造成异质程度改变。线粒体 靶向RE最初用于异源线粒体的杂合细胞。【18】因大鼠mtDNA缺乏PstI位

21、点， 线粒体PstI RE(mito-PstI)的表达能够改变同时含有小鼠和大鼠融合细胞的 mtDNA异质性。含两种鼠类 mtDNA单体型(BALB和NZB)的无症状小鼠模 型的体外和体内试验表明，用重组病毒载体定位于线粒体的REs表达可以有效地改变mtDNA异质性。【19】这两种mtDNA单体型能够通过 RE ApaLI区分， 它能识别BALB mtDNA的一个位点，而不能识别 NZBmtDNA中的位点。正因 为只有BALB mtDNA突变体含有ApaLI特异性酶切位点，异质小鼠局部注射 编码线粒体靶向ApaLI RE(mito- ApaLI)的重组腺病毒后，肌肉和脑部显示快 速、定向且彻底

22、的mtDNA异质性改变。mtDNA异质性改变的程度和效率依赖 于未被剪切的 mtDNA数量。【20】因为ApaLI只剪切BALB mtDNA,余下的NZB mtDNA继续复制以维持正常 mtDNA拷贝数，因此没有观察到明显的mtDNA耗损。线粒体靶向REs可以作为异质性改变的策略，但是主要的局限是合适的 限制性位点的临床相关突变极少。2、蛋白质转导/蛋白质转染由于mtDNA编码的线粒体蛋白是疏水性的，这给外源蛋白的导入带来一定的 难度，蛋白质转导则是一种忽略蛋白质自身特性的新型导入方法，有细胞渗透性质的蛋白质转导结构域的发现为克服上述问题提供了可能性。最常用的蛋白质转导结构域是TAT,它是HI

23、V上较大的短阳性肽，能够穿过细胞膜。【21】TAT融 合蛋白耦合细胞核定位信号(nuclear localization signal, NLS) 或线粒体靶向序 列(mitochondrial targeting sequence, MTS)能够转导进入细胞并定位保留在亚细胞相应区域。线粒体成功靶向导入的报道见于TAT介导的硫辛酰胺脱氢(lipoamidedehydrogenase, LAD),利用固有的 MTS恢复了 LAD缺陷患者细胞 内线粒体丙酮酸脱氢酶复合体的活性。【22】蛋白质转导的优势在于跨膜转运不依 赖TIM和TOM复合体，而劣势在于这是一种短暂的修复作用。3、清除核甘文档来源

24、为：从网络收集整理.word版本可编辑.欢迎下载支持线粒体神经胃肠型月而肌病 (mitochondrial gastr-ointestinal encephalopathy, MNGIE)属多系统疾病，患者常表现为严重的胃肠道功能障碍伴外周神经变性及 脑白质异常等，主要由胸腺磷酸化酶(thymidinephosphorylase, TP) 缺陷导致。1231 TP活力降低可引起血液中脱氧胸昔和脱氧尿甘水平上升。目前，清除血液 中的核昔有三个方法：血液透析、异源干细胞移植和血小板灌注。四、展望近年来科学水平飞速发展，各个科学领域都取得了重大突破，生命科学领域尤为 突出，故而在线粒体疾病研究方面可

25、能会在近十年取得重大突破， 对线粒体结构 及其内部酶的结构研究，将会对人类未来生命科学做出巨大贡献。参考文献【1】、张丽珊等.国外医学遗传学分册，1995;18(1):3【2】、戚豫等.中华医学遗传学杂志,1995;12(2):89【3】、李方园，等.中华医学遗传学杂志，1994;11(4):193【4】、张庆等.中华医学遗传学杂志,1997;14(2):88【5】、张庆等.中山医科大学学报,1997;18增刊:57【6】、卢义钦等.国外医学分子生物学分册，1996;18(3):135【7】、周小龙，王恩多.与人类疾病相关的几种线粒体氨基-tRNA合成酶.生物化学与生物物理进展。【8】、张均田.脑缺血、葡萄糖/能量代谢障碍与神经退行性疾病.中国药