农药残留分析第四章农药残留测定方法4

1、农药残留分析 4.4色谱质谱联用技术随着我国加入WTO后，对食品质量和安全的要求与国际逐步接轨，对样品中未知农药多残留成分分析成为农药残留分析和管理工作的重要内容。随着提取技术的完善，以及近年来色谱质谱联用技术突飞猛进的发展，为农药残留定性分析、多残留分析、农药环境转归和安全性评价研究提供了一个极好的平台。色谱质谱联用技术不仅可以对待测的农药定性同时也可以定量，是农药残留分析的最佳手段之一，色谱质谱联用仪为现代农药残留分析实验室必备的仪器设备。为更好地掌握色谱质谱联用技术在农药残留分析中的应用，在学习和掌握气相色谱和高效液相色谱知识的基础上，对质谱基本知识加以介绍。4.4.1质谱的基本知识19

2、10年，英国剑桥大学卡文迪许(Cavendish)实验室的汤姆逊(Thomson)研制出了世界上第一台具有现代意义的质谱仪，同时汤姆逊用这台仪器首次发现了同位素的存在。到了20世纪30年代，科学工作者已经用质谱法鉴定了大多数稳定的同位素，并精确的测定其质量，同时还建立了原子质量不是整数的概念。1965年，瑞典LKB公司推出了第一台商品气相色谱质谱联用仪。20世纪60年代开始，质谱法已经普遍地应用到有机化学和生物化学领域，逐渐成为研究机构一般实验配置的仪器。质谱作为鉴定有机物结构的主要方法之一，相比于紫外光谱、红外(或拉曼)光谱、核磁共振波谱，质谱具有两个最突出的优点，一是灵敏度远远超过其它方法

3、，样品的用量不断降低；二是质谱是目前唯一可以确定分子式的方法，而分子式对推测结构至关重要。质谱法的不足是仪器结构复杂，造价较高。另外，在进行复杂分子的结构分析时，对分子空间构型和各种结构单元的联结方式的准确区分与判断存在局限性。质谱方法大致可以分为同位素质谱分析、无机质谱分析和有机质谱分析，农药残留分析主要属于有机质谱分析范畴。质谱分析法是利用其独特的电离过程及分离方式来实现定性和定量分析的。它是将物质离子化，按离子质荷比分离，然后测量各种离子峰的强度而实现分离的一种方法。质量是物质固有特性之一，不同的物质有不同的质量谱，利用这一性质，可以定性分析，峰强度也与它代表的化合物含量有关，利用这一特

4、性，可进行定量分析。农药的质谱分析不同于色谱的方法，其定性的依据不仅是保留值或相对保留值，更重要的是农药分子结构特征的离子碎片，这样就增加了定性的可靠性，避免由于复杂的样品基质中带来的干扰，即相对保留时间相同而特征碎片离子(或全扫描质谱图)相同的农药我们才能做出定性和定量的判定，这样定量结果的准确性也有了更充分的保证。1.质谱的重要名词和术语离子源(IonSource)：质谱仪器中使样品电离生成离子的部件。质量分析器(Massanalyzer)：质谱仪器中使离子按其质荷比大小进行分离的部件，如四极杆滤质器等。离子检测器(Iondetector):质谱仪器中检测离子丰度的部件。质量歧视效应(Ma

5、ssdiscriminationeffects)：质谱仪器中的一些部件，如离子检测器,对不同质量的离子产生不同响应的现象。质量方程(Equationformassspectrometer)研究磁偏转质谱仪器推导出的反映离子运动状态的方程：H2R2m/z=(4.42V式中：m/Z-离子质荷比；H-磁场强度；R-离子运动的曲率半径；V-加速电位。此方程可描述质量分析器工作原理。分辨率(Resolution,R)：在给定样品的条件下，仪器对相邻两个质谱峰的区分能力。相邻等高的两个峰，其峰谷不大于峰高的10%时，就定义为可以区分。分辨率R的表示法是峰谷为峰高的10%时，两峰质量的平均值与它们质量差的比

6、值：(4.即式中M为两峰质量的平均值，M为两峰质量差。分辨率一般500即可满足要求，仪器上一般用R=2M表示。灵敏度(Sensitivity)：灵敏度是质谱仪器对样品量感测能力的评定指标，是指在规定条件下，对选定化合物产生的某一质谱峰，仪器对单位样品所产生的响应值。通常，如气质联用仪用六氯苯表示灵敏度，S/N40。质量范围(Massrange)：质量范围是评定质谱仪器性能的参数之一。它描述仪器所能测量的最轻和最重离子之间的质量范围。接口(Interface)：用于协调联用的两种仪器的输出和输入状态的硬件设备。它既能除去大量的破坏质谱离子源的高真空度的流动相，同时又能将样品传递到质谱离子源中。如

7、液-质联用仪的接口，大气压化学电离APCI。全扫描离子检测(Fullscan)：对在离子源室产生的在记录槛值以上的离子检测的一种方式。适用于定性分析(图4-47)。选择离子检测(Selectedionmonitoring,SIM)：选择离子检测技术是对混合物进行定量分析的一种常用方法。选择能够表征该成分的一个或几个质谱峰进行检测。这种方法的灵敏度高于常规方法，相当于气相色谱的选择性检测器，多用于痕量成分的测定(图4-48)。农药残留分析农药残留分析22190681030922190681030994647947坐所作”见，”.II-I-II20405080100质荷比(Masschargera

8、tio,m/z)：离子质量(以相对原子量单位计丿与它所带电荷(以电子电量为单位)的比值，写作m/z或者m/e。峰(Peaks):质谱图中离子信号通常称为离子峰，如图4-47中的m/z94,m/z141等。离子丰度Abundanceofions:检测器检测到的离子信号强度。离子相对丰度(Relativeabundanceofions)：以质谱图中指定质荷比范围内最强峰为100%，其它离子峰对其归一化所得的强度。标准质谱图均以离子相对丰度值为纵坐标。基峰(Basepeak):在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称为基峰，其相对峰度为100%。如图4-47中m/z94。分子离子(Molecu

9、larion，M+)：分子失去一个电子生成的离子。它既是一个正离子，又是一个游离基用M+表示。分子离子的质荷比等于分子量。如图4-47中的m/z141离子峰。5001011510.210.3SIMBrowser-学实E标.DO,实验.METTICRet.Time10.190Scan#58FileDisplaygetupTablePeakDetEctLib.SearchReportHelp10.5TICx1.0183.00z1.0cn219.00K1.0bU10S.95x1.0M/ZRel.lnt.TIC|n|I303,166-I21S1FragmentTable.!I979,20610.1Co

10、ntirolFanwlt157,659占卜|Ret.Time11.136Scan#339Intensity652,722Col.Temp212Peak|卜|Scan|*|lonset|农药残留分析农药残留分析 准分子离子(Quasi-molecularion)：指与分子存在简单关系的离子，通过它也可以确定分子量。分子得到或失去一个氢生成的M+H+或M-H+是最常见的准分子离子。碎片离子(Fragmentions)：分子离子在离子源中经一级或多级裂解生成的产物离子。如图4-47中的m/z47，m/z64等。亚稳离子(Metastableions)：亚稳离子是指那些在离开离子源之后，到达检测器之前

11、这一区域中发生裂解反应的离子。它们一般呈现为很弱的宽峰，出现在非整数质量处。同位素离子(Isotopeions)：由相同原子的不同的同位素构成的碎片离子称为同位素离子。重排离子(Rearrangementions)：由原子或基团重排或转位而生成的碎片离子。本底(Background)在与分析样品相同的条件下，不送入样品时所检测到的质谱信号。亦称本底质谱。母离子(Parentions)：在任一反应中发生裂解的离子。分子离子在裂解反应中总是母离子。总离子流图(Totalionscurrent,TIC)：在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图。在色谱一质谱联用时，TIC相当于

12、色谱图(图4-49)。2.质谱仪及实现质谱分的带电气态离子合适的进样装置离子经过适当的集不同信号而进行处理分析。为了获得对离子的良好分析，必须避免离子损失，因此凡有样品分子及离子存在和通过的地方，必须处于真空状态。质谱仪的基本结构如下（见图4-50）：样品运动途径图4-50质谱仪器的工作方框图信号传输或控制信号反馈.进样系统气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）和直接进样（DI）都可以作为MS的进样系统，但是当用GC或HPLC作为进样系统时应包括接口。也就是说，进样系统要能高效反复地将样品引入到离子源中，但不能使其内部真空度明显下降。将GC作为进样系统时一般就称为气谱一质谱联用仪；HPLC

13、与MS连接时称为液谱一质谱联用仪；MS与MS连接时称为串联质谱。DI（图4-51）作为进样器在质谱分析中是很实用的，有些组分热解或分子量大，可用薄层色谱、柱层析等方法分离纯化后，直接进样分析。图4-51质谱仪直接进样.离子源离子源是质谱仪的心脏，其功能是将引入到离子源室的气态以将离子源看作一台比较高级的反应器，其中样品在其内部发生分解作用在很短时间（vls）内发生，以利于快速获得质谱。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同分子应选择不同的离r子化方法，即不同离子源或样品的离子化系统（表4-21）。通常给样品较大能量的电离方法称为硬电离方法，如电子轰击离子源EI，而给样品较小能

14、量的电离方法为软电离方法，如化学电离CI。软电离方法适用于易破碎或易电离的样品。表4-2质1谱法中常见的几种离子源常用的离子源类型离子化方式应用年代电子轰击禺子化EI气相高能电子1920化学电离CI气相反应气体1965场电离FI气相高电势电极1970场解吸FD解吸高电势电极1969快原子轰击FAB解吸高能原子束1981激光解吸LD解吸激光束1978电喷雾电离ESI气相高电压1984大气压化学电离APCI气相电晕放电1981下面重点介绍电子轰击离子源，化学电离源和大气压化学电离源。.电子轰击离子源电子轰击离子源（Electronimpact,El）是研究最早，技术最成熟，应用最广泛的离子源，是台

15、式四极杆质谱仪最基本的配置。其构造原理如图4-52，电子由直热式阴极（多用铼丝制成）发射，在电离室和正极之间施加直流电压（70V）,使电子得到加速而进入电离室中。当这些高能电子束从试样分子中撞出一个电子而产生正离子，即电子束能产生各种能态的M+，若产生的分子离子带有较大的内能（转动能，振动能和电子跃迁能），可以通过碎裂反应释放能瞳，如：血2，！.M+2e-式中M为待测分子，M+为分子离子；MJ,M2+等为较低质量的离子。分子中各种化学键的能量最大为几十个电子伏特，电子轰击的能量远远超过普通化学键的键能，过剩的能量会引起分子多个键的断裂，可以提供分子构成的重要官能团的信息。但是，对于极性大，难气

16、化，热稳定性差，相对分子质量较大的化合物，在加热和电子轰击下，分子易破碎，给不出完整的分子离子信息，难于解析。太低的电子大大降低；太高在采用电子轰击获得的，因此只化学电化学电离源（ChemicalImpact,CI）是利用咼能量的电子（100eV）轰击反应气体，使之电离，电离后的反应分子再与有机化合物样品的分子发生碰撞，进行分子一离子反应而生成样品分子离子的一种“软”电离方法，可以避免分子离子的进一步碎裂，所得质谱图中分子离子峰和准分子离子峰较强，其碎片离子峰很少，很容易得到被测样品分子的分子量。化学电离源已经逐步成为GC-MS的基本配置，它的结构基本上与电子轰击电离源相同，只是化学电离源的电

17、离盒要有较好的密封性。化学电离源所用的反应气可根据所分析的待测物来选择，常用的有甲烷、异丁烷和氨气等。化学电离源用活化离子碰撞气态样品分子产生的准分子离子剩余内能较低，故准分子离子稳定。在化学电离源谱图中准分子离子(M-H)+往往是基峰，质谱图简单，易于解析。大多数化学电离源是以甲烷为反应气体。甲烷在电子轰击源的轰击下，发生下列反应:CH4+eCH4CH4CH3*+H*CH4*+CH4仝吋CH3t+CH4C2H5+H2在这些反应中，生成的CH5+约占48%,C2H5+约占41%。这些二级活化离子与气态样品分子反应生成(M+H)+、(M-H)+：CH扌+M(M+CH4屈+1C2H?+M*(M+H

18、J1+-C2H4嗣+1CH$+M(眄H)+CH斗+It施-1:丘2扌+M(皿附+裁1百1二级活化离子与气态样品分子还可以进行复合反应生成(M+17)+和(M+29)+：CH扌+M(M+C零+施+17C讯扌+M(M+QHR+施+29化学电离源还可以用于负离子质谱分析，对于多数有机化合物来说，负离子的化学电离源质谱图灵敏度要比其正离子的化学电离源质谱图高23个数量级。负离子化学电离源质谱法已经逐渐成为农药残留分析的定量分析方法，但是它对难挥发、热不稳定或极性较大的农药适用性差。.大气压化学电离离子源大气压化学电离离子源(Atmosphericpressurechemicalionization,A

19、PCI)用于LCMS,该技术与传统的化学电离接口不同，它不采用诸如甲烷一类的反应气体，而是借助电晕放农药残留分析农药残留分析电启动一系列气相反应以完成离子化过程。大气压化学电离离子源接口的结构见图4-53。它是目前LC-MS联用的技术上最为成熟的接口之一。当液相色谱的流动相经毛细管被雾化气体和辅助气喷射进入100120C加热的常压环境中，通过加热喷射形成雾滴，在喷嘴附近放置一针状电晕放电电极M,通过高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生例如丰富的h3o+、o2-和O-等离子。当喷射出的气溶胶混合物接近放电电极时，大量的溶剂分子也会被电离，上述大量的离子与分析物分子进行气态离子一分子反应，从而

20、实现化学电离，形成质子转移加成物等准分子离子。农药残留分析农药残留分析农药残留分析农药残留分析.质量4,5-加热器；6,7,8气帘；9,10“低温外売，11锥孔-图”4孑3一大气压化学noizxj1=1一中口/少d丄inurzi7trip。装填缓冲液是分离的基本要求，对毛细管进行清洗是保持高效和重现分离的首要条件。通常采用正压或负压来填充或冲洗毛细管。毛细管是分离最关键的部件，通常由外壁涂聚酰亚胺的弹性熔融石英管拉制而成。在电泳分离过程中，由于存在焦耳热效应，温度农药残留分析农药残留分析152152农药残留分析 #的升高将影响分离的效率，因此需要有温控系统。商品化仪器常采用液冷的方式，液冷的方

21、式通常比风冷方式好。毛细管电泳的电流回路系统包括高压电源、电极、电极槽、导线和电解质缓冲溶液等。电源一般采用土连续可调的直流高压电源，电极通常由直径的铂丝制成。缓冲液中含有电解质，充填于电极槽和毛细管中，通过电极、导线与电源线连通。毛细管电泳仪的检测器通常为紫外吸收检测器和激光诱导荧光检测器，这两种检测器经过改进后，灵敏度有了显著地提高，有很强的实用性。紫外检测器多为二极管阵列式，可扫描绘制三维光谱图。在农药残留分析中的应用报道了采用高效毛细管电泳法，紫外检测器同时测定马铃薯中百草枯和敌草快。等年采用高效毛细管电泳技术分离测定了苯氧羧酸类除草剂和其异构体。测定了谷物中磺酰脲类除草剂；在另外的研

22、究中还用毛细管电泳一液质联用技术测定了水中的磺酰脲类除草剂。等报道了用毛细管电泳方法测定大豆中的几种极性除草剂，包括咪唑喹啉酸、氯嘧磺隆、嘧吩磺隆、三氟羧草酸、灭草松和一。在对大豆样品净化方面，做了大量的研究工作，涉及液液分配，凝胶渗透色谱，半制备处理，以及各种不同固定相和洗脱体系的固相萃取法，最后选择加压液相萃取法（）净化，获得较为满意的结果。毛细管电泳法，采用的醋酸铵缓冲溶液，毛细管柱内径m长，施加电压，整个分析周期m以氯磺隆作为内标物，用高灵敏度紫外检测器在波长下检测。各种除草剂的电泳图如图6检出限分别为，灭草松，三氟羧草酸咪唑喹啉酸，嘧吩磺隆，氯嘧磺隆。以最大允许残留限量浓度添加，6种除草剂中只能检测出4种（嘧吩磺隆，咪唑喹啉酸，三氟羧草酸，2,4）-，其中2,4，-三。氟羧草酸，咪唑喹啉酸的回收率大于70，%变异系数为11；%高浓度的添加回收率6种除草剂均大于70以%上，变异系数小于10。%大豆添加回收电泳图见图4-。7上图按每种农药最大允许残留量添加的谱图；下图为大豆提