黄曲霉素测定方法

1、黄曲霉毒素测定法1简述黄曲霉毒素可以有曲霉菌黄曲霉、寄生曲霉、集封曲霉和伪溜曲霉4种真菌产 生，是一组化学结构类素的二呋喃香豆素的衍生化合物，中药在贮藏、制备、运 输过程中如保存不当有受潮霉变而污染黄曲霉毒素的可能。黄曲霉毒素是目前世 界上已知的毒性最强的化合物之一，其致癌性肯定。对中药中黄曲霉毒素残留量 进行严格控制对保证药用安全具有重要意义。本法的基本原理为样品经有机溶剂提取、免疫亲和柱净化后，利用高效液相 色谱分离，柱后碘衍生-荧光检测器检测进行分析测定。2仪器与用具2.1高速匀浆机、振荡器2.2高效液相色谱单元，配荧光检测其（具360nm激发波长和大于420nm发射波长）2.3柱后衍生

2、系统2.4离心机2.5超纯水处理系统2.6黄曲霉总量（BB2、GG2）免疫亲和柱2.7固相萃取装置2.8离心管，具塞锥形瓶，刻度浓缩瓶，移液管，容量瓶等。3试药与试液3.1甲醇、乙腊均为色谱纯。3.2水位高纯水。3.3黄曲霉毒素混合对照品。3.4 0.05%的碘溶液：取碘0.5g，加入甲醇100m l使溶解，用水稀释至1000ml即 得。4.色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙 腊-水（40:18:42）为流动相，流速每分钟0.8m；采用柱后衍生法检测，（1）碘 衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5甘，加入甲醇100m l使溶解，用水稀 释至1000

3、ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70C ；以荧光检测 器检测，激发波长Aex =360nm，发射波长Aem =450nm。进样量：2050 ix l （视 灵敏度进行调整）。按上述条件操作，理论板数以B计应不低于5000，两个相邻色谱峰的分离度应大 1于 1.5。5.操作方法5.1混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合标准品（黄曲霉毒素B1、 B2、G1、G2标示浓度分别为 1. 0pg/ml、0.3pg/ml、1.0pg/ml、0.3pg/ml、）0.5ml， 置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1ml，置25ml 量瓶中，用70%甲醇稀释

4、至刻度，即得。5.2供试品溶液的制备取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，加入氯化 钠3g，置于均质瓶中，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度 大于11，000转/分），离心5分钟（离心速度2500转/分），精密量取上清液15ml， 置50m l量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45pm）滤过，量取续 滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20m l分两次洗脱，洗脱液 弃去，使空气进入柱子,将水挤出柱子，再用1.5ml甲醇分次洗脱，收集洗脱液，置 2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。5.3测定法分别精密吸取上述混合对照品溶液5p

5、l、10pl、15pl、20pl、25pl，注 入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲 线。另精密吸取上述供试品溶液2025pl，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标 准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素BB2、GG2的量，计算，即得。6注意事项6.1本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。6.2残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有 10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。实 验废液也需加入次氯酸钠进行处理。6.3紫外线对低浓度黄曲霉素有一定的破坏性，所以混合黄曲霉毒素对照品储 备液应配制在棕色容量瓶

6、中，并避光保存。混合黄曲霉毒素对照品溶液则需临用 新配吗，并注意避光。6.4当供试品试液进样量超过20Ml时，为保证获得良好的额色谱峰形，供试液 制备中最后可用水稀释至刻度。6.5随行回收绿：加标浓度1.0p g/Kg,回收率应在50%120%；加标浓度110 p g/Kg，回收率应在70%110%。6.6方法检出限以黄曲霉毒素b1计应不得高于0.5p g/Kg。7附注：光化学衍生法除上述中国药典2010版已收载的柱后碘衍生-荧光检测测定方法外，柱后 光化学衍生-荧光检测测定方法在仪器性能和测定的稳定性方面也有明显的优 势。7.1仪器与用具光化学衍生器7.2色谱条件与系统适应性 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温：40C； 以甲醇-乙腊-水为流动相，按下表进行梯度洗脱，流速1