蛋白质组学课件

1、蛋白质组学课件蛋白质组学内容1：什么是蛋白质组学，为什么研究蛋白质组学2：蛋白质组学研究内容3：蛋白质组学研究策略（本公司提供的服务） 3.1：比较蛋白质组学研究方法。 3.2：蛋白质翻译后研究方法。4：蛋白质组学在疾病，植物，动物等方面的的应用 1：蛋白质组学定义及研究意义1.1：蛋白质组学定义（proteome) 一个基因组，一个细胞或组织，一种生物在一定时间，一定条件下所表达的全部蛋白组成，存在形式，活动方式及时空动态。1.2：为什么除基因组学外还要研究蛋白质组学： （1）蛋白质是功能的执行者。 （2）基因组与蛋白质组不一样：转录后的选择性剪切，翻译后的修饰等等，导致蛋白质组远比基因组复

2、杂。 （3）与基因组相比，蛋白质组具有以下特点：多样性，无限性，动态性，相互作用，时空变化，需要多种技术，组学间的互助 2：蛋白质组学研究内容2.1：蛋白质的表达模式 （1）生理、病理或不同发育状态下蛋白质组表达差异蛋白质信息库。 （2）蛋白质及其组成质点的分离、分析、鉴定。2.2：蛋白质的功能模式 （1）蛋白质结构分析。 （2）蛋白之间相互作用，翻译后修饰，细胞定位等。 2.1：蛋白质组学研究内容 2.3：蛋白质组学研究策略（本公司提供的服务）：比较蛋白质组学研究方法。 （1）：经典双向电泳方法 （2）：DIGE （3）：SILAC （4）：iTRAQ：蛋白质翻译后研究内容。 （1）：磷酸化

3、修饰分析 （2）：糖基化分析 （3）：二硫键分析 （4）：其他 1：常规双向电泳一、双向电泳概述： 双向电泳(Two-dimensional electrophoresis)的基本原理是利用蛋白质的等电点（pI)和分子量(Mr)不同而分离蛋白质：第一向电泳等电聚焦（Isoelectric Focusing，IEF）根据蛋白质的等电点不同将蛋白质分离，第二向电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDSPAGE）利用蛋白质的分子量大小不同将蛋白质分离。 双向电泳一次可以从细胞、组织

4、或其它生物样本中分离上千种蛋白质，凝胶上的斑点都对应着样品中的蛋白质，且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能通过质谱鉴定和软件分析获得。因此其在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌症研究等领域都得到了广泛的应用。二：双向电泳分离蛋白质混合物具有以下优势： 1、经典方法、应用范围广、适用于各类材料； 2、经济实惠，可大规模多个样本筛选和分析。 1：双向电泳 基于2D的经典定量分析方法。 1、样品准备和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。 2、蛋白质分离：蛋白质经过2D分离后染色（银染、考染等）。 3、蛋白质的定性与定量分析：通过与对照组相Image Master

5、7.0分析出实验组中差异点，质谱鉴定差异点蛋白质,同时应用软件分析出其表达量的变化。2：DIGE 简介： DIGE 双向荧光差异凝胶电泳，利用荧光染料（Cy2, Cy3, Cy5）能与蛋白质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标记，标记后蛋白质的等电点和分子量基本不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。技术优势： 1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量； 2：与常规银染相比灵敏度更高； 3：检测动态范围更大； 4：定量精确, 采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差； 5：统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件可以得到

6、统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏差。2：DIGE DIGE荧光定量方法流程图. 1、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有实验组与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。 2、蛋白质分离：等量混合三种荧光素标记后的蛋白质，2D电泳分离，荧光显色。 3、蛋白质定量分析：Image Master 7.0（DIGE)分析同一蛋白质不同处理后的表达量变化。3: 化学标记法iTRAQ简介： iTRAQ试剂是可与氨基酸末端氨基及赖氨酸侧链氨基连接的胺标记同重元素。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。 在串联质

7、谱中，信号离子表现为不同质荷比(113-119，121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以鉴定出蛋白质和分析出同一蛋白质不同处理的定量信息。iTRAQ 结构 iTRAQ包括三部分：报告部分、肽反应部分、平衡部分。 1、报告部分：有八种，因此iTRAQ可同时标记8组样品。 2、肽反应部分：能与肽N端及赖氨酸侧链发生共价连接而标记上肽段，几乎可以标记所有蛋白质。 3、平衡部分：保证iTRAQ标记的同一肽段的质荷比相同。 3: 化学标记法iTRAQ与传统基于双向电泳定量分析相比，iTRAQ具有以下技术优势：1：灵敏度高，检测限低，可检测出低丰度蛋白；2：分离能力强,分析范围广,iTRAQ可以对任何

8、类型的蛋白质进行鉴定，包括高分子量蛋白质、酸性蛋白和碱性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋白。3: 高通量：同时对8个样本进行分析，提高了实验通量，可同时对多个时间点或不同处理的蛋白质进行分析； 4：结果可靠：定性与定量分析结果更加可靠；5：自动化程度高：液相与质谱连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。 3: 化学标记法iTRAQ iTRAQ法。 1：样本经过不同处理后，提取蛋白质; 2：蛋白质经过还原，封闭后胰蛋白酶酶切; 3：肽段混合物分别用不同的iTRAQ标记; 4：等量混合各种iTRAQ试剂标记的肽段; 5：MS/MS质谱检测及分析。 4: SILACSILAC即细胞培养条件下稳定同位素标记技

9、术(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，其基本原理是在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，用于SILAC主要的稳定同位素氨基酸是Lys和Arg, 细胞在传代培养过程中同位素氨基酸将被细胞用于合成蛋白质，细胞经传代培养5-6代后，细胞的所有蛋白质将被同位素标记，等量混合标记的蛋白质后经过SDS分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中三个同位素型肽段的面积大小进行相对定量，同时二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。由于SILAC标记技术是体内标记技术，几乎不影响细胞的功能，

10、同时灵敏度高，因此其在蛋白质组学相关领域中得到了广泛的应用，如比较蛋白质组学，蛋白质与蛋白质相互作用，蛋白质与DNA相互作用，蛋白质与RNA相互作用等领域。 4: SILAC 技术优势目前比较蛋白质组学最先进方法 （1）高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%； （2）定量精确：线性范围广，降低由于样品制备不同而造成的实验内差异； （3）高通量、灵敏度高：可同时鉴定并定量数百至数千种蛋白质，且检可测测到纳克级水平； （4）相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记； （5）灵活性：在缺乏L-赖氨酸和L-精氨酸的培养基中添加同

11、位素标记的这两种氨基酸，操作方便。 4: SILAC SILAC法。 1、标记：在缺乏Lys和Arg的培养基中添加Lys和Arg的同位素Lys(D4或13C6 15N4)、Arg(13C6,或13C6 15N4)等培养细胞，使蛋白质被标记成“中型”或“重型”； 2、细胞处理，如药物处理； 3、细胞裂解、提取蛋白质； 4、等量混合对照与处理组蛋白质、SDS电泳、染色； 5、割取蛋白质条带，胰蛋白酶消化，质谱分析。：蛋白质翻译后研究内容（1）：磷酸化修饰分析（2）：糖基化分析（3）：二硫键分析（4）：其他 （1）：磷酸化修饰位点鉴定 2.3.2 ：其他修饰位点鉴定（2）：糖基化分析（3）：二硫键分

12、析（4）：其他 4：蛋白质组学在植物，动物，微生物等方面的的应用植物蛋白质组学研究内容： （1）：作物蛋白质组学 A: 不同组织器官蛋白质组学 B: 作物遗传多样性 作物品种资源的亲缘关系鉴定 作物品种鉴定 C: 作物发育蛋白质组学 D: 作物抗逆、抗病相关蛋白质组学 E: 病原菌致病相关蛋白 F: 蛋白质标记遗传作图与数量性状QTL定位 （2）：豆科植物与根瘤菌互作蛋白质组学 （3）：禽兽蛋白质组学 （4）：其他 4：蛋白质组学在植物，动物，微生物等方面的的应用动物科学研究领域的应用 （1）：家禽、昆虫等物种遗传多样性分析 （2）：家蚕、害虫等物种免疫与抗逆生理研究 （3）：畜禽产品质量相关形状研究 （4）：畜禽疾病生理研究 （5）：水生生物疾病生理研究 （6）：其他 微生物研究中的应用。 （1）：病原微生物治病相关蛋白的鉴定 （2）：食源性病原微生物相关蛋白的鉴定 （3