DNA的复制幻灯片

1、A gene participates in three major activities:1. Information Storing2. Replication3. Accumulating mutations第四章 DNA的复制Information StoringAccumulating mutationsReplicationDNA的复制（replication）是指以原来的DNA分子为模板合成出相同的DNA分子的过程。遗传信息通过亲代DNA分子的复制传递给子代。DNA复制在保持生物物种遗传的稳定性方面起着重要的作用。从Watson和Crick建立DNA结构的双螺旋模型开始，关于DN

2、A复制的轮廓就已经诞生。“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.”“Now our model for deoxyribonucleic acid is, in effect, a pair of templates, each of which is complementary to the other. We imagine tha

3、t prior to duplication the hydrogen bonds are broken, and the two chains unwind and separate. Each chain then acts as a template for the formation onto itself of a new companion chain, so that eventually we shall have two pairs of chains, where we only had one before. Moreover, the sequence of the p

4、airs of bases will have been duplicated exactly. DNA复制和细胞周期的关系：DNA复制是细胞周期的决定因素，DNA复制完成以前，细胞不会发生分裂。DNA复制的完成是细胞分裂的触发点，复制后的基因组被平均分配到两个子细胞中去。细胞周期调控基因控制DNA的复制并触发细胞分裂。第一节 DNA的复制概况 一、DNA的复制机制 DNA分子的碱基互补配对原则是DNA分子结构的基础，这个原则在DNA的复制过程中也起着重要的指导作用。 理论上，DNA的复制可以采取半保留复制、全保留复制和混合复制（散布式）三种方式。半保留复制机制的证明Meselson-Stah

5、l实验1958年，Matthew Meselson和Franklin Stahl设计了一个很巧妙的实验，证明了DNA复制采取半保留复制机制。 两个子代DNA分子通过细胞分裂平均分配到两个子代细胞中。由于每个子代细胞中只有一半的遗传物质是来自亲代细胞，而另一半是新合成的，这种复制方式被称为半保留复制（semiconservative replication）。半保留复制是双链DNA普遍采用的复制机制。即使是单链DNA分子，在其复制过程中也要先形成双链的复制形式。半保留复制机制说明了DNA在代谢上的稳定性。半保留复制作为一个复杂的过程，需要多种细胞组分的参与。同时为保持遗传的稳定性，要有高度的忠实

6、性。二、DNA复制的起点、方向和方式 DNA复制的起点 原核生物DNA的复制是在DNA分子的特定位点开始的，这一位点称为复制起点，常用ori来表示。 原核生物的染色体只有一个复制起点，复制从起点开始，进行到终点结束，完成整个染色体DNA分子的复制。将一段来自起点的DNA序列与缺失起点的DNA分子克隆到一起，如果来自起点的DNA片段包括一个复制起点所必须具备的序列，它将支持与其连接的任何DNA序列的复制。由此可以鉴定起点的DNA序列。细菌、酵母以及叶绿体、线粒体的DNA复制起点现均已经被克隆，其核酸序列也被确定了，它们的共同特点是富含A-T序列。 真核生物DNA的复制也是从特定的位点开始的，以双

7、向延伸的方式进行，直到终点为止。 真核生物DNA的复制是从多个位点开始 的，所以真核生物的DNA分子上有多个复制单位同时进行DNA的复制。 复制子（replicon） 复制子是基因组中能够独立进行复制的单位。每个复制子都有控制复制开始的复制起点（origin）以及终止复制的终点（terminus）。任何起点和终点之间的序列都作为复制子的一部分参与复制。 在一个细胞周期中，每个复制子只启动一次。 原核生物细胞的基因组只有一个复制子。细菌内的质粒是一个自主复制的环状DNA基因组，构成一个独立的复制子。真核生物的DNA分子上有多个复制子。参与复制的DNA分子上有两个区域，未复制的区域由亲代DNA组成

8、，已复制的区域由两条子代链组成。复制正在发生的位点叫做复制叉（replication fork）或生长点（growing point）。DNA复制的方向复制可单向进行，也可以双向进行，这取决于在起点有一个还是两个复制叉。DNA复制的方式大多数生物体内DNA的复制都以双向等速方式进行。但枯草杆菌两个复制叉的移动是不对称的。质粒ColEI的复制完全是单向进行的。大多数生物体内的DNA复制都以对称方式进行，即DNA分子的两条链同时复制。但也有在一定时期内DNA只复制一条链的情况。例如线粒体的D环复制和一些细菌噬菌体的滚环复制方式。 三、DNA聚合酶与DNA聚合反应 DNA的复制是由DNA聚合酶（DN

9、A polymerase）负责完成的，它具有按照模板的指令在模板链上催化新DNA链合成的活性。 DNA聚合酶是一种模板指导的聚合酶，产物DNA与模板的碱基组成相同。说明在DNA聚合酶的作用下，DNA的两条链都能复制。 在适量DNA和镁离子存在下，DNA聚合酶催化4种脱氧核糖核苷酸合成DNA，每次在DNA的3-OH末端加入一个核苷酸使DNA链由5向3方向延长，同时释放无机焦磷酸。四、复制的基本过程DNA的复制包括起始、延伸和终止三个步骤。复制调控主要发生在起始阶段，复制子增殖依赖于起始过程起点处发生的相互作用。一般复制开始后，就会进行到底，直到整个基因组都复制完毕。五、DNA复制的半不连续性当复

10、制叉前进时，在两个暴露的亲链上都要进行子链的合成。但是DNA分子的两条链是反向平行的，而且所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是53，即新生链的方向只能是53。 DNA在复制时如何同时作为模板合成其互补链?In 1968, Reiji Okazaki concluded that DNA replication in E. coli (and in other organism) is semidiscontinuous. One strand (leading strand)is replicated continuously in the direction of the movement

11、of the replicating fork; the other (lagging strand)is replicated discontinuously as 1-2 kb Okazaki Fragments in the opposite direction. This allows both strands to be replicated in the 5-3-direction.第二节 DNA的复制体系一、复制体系的鉴定 人们一般通过突变体表型的变化来考察基因的功能，如果某个基因突变导致细胞DNA不能复制，就可以说这个基因与DNA复制有关。 利用大肠杆菌的温度敏感突变体已经鉴定

12、了一系列的dna基因座。对参与DNA复制的蛋白质进行识别和鉴定的方法有三种：纯化、突变、重建。体外互补实验是鉴定复制体系组分的重要手段。二、DNA聚合酶 1 大肠杆菌的DNA聚合酶 大肠杆菌中发现了三种DNA聚合酶：DNA聚合酶、DNA聚合酶、DNA聚合酶。 DNA聚合酶参与损伤DNA的修复，并在半保留复制中起切除RNA引物的作用。 DNA聚合酶也参与修复。 DNA聚合酶是一个多亚基的蛋白质，是合成DNA新链的主要复制酶。DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶是第一个被鉴定的DNA聚合酶，它是由polA基因编码的103 kDa的单链多肽。 当底物和模板存在时， DNA聚合酶可使脱氧核糖核苷酸依次加

13、到具有3OH末端的多核苷酸链上。它的催化需要引物链（DNA或RNA）的存在。DNA聚合酶是一个多功能酶，它可以催化以下的反应：1、DNA链沿5 3方向的延长（DNA聚合酶活性）。2、从3端水解DNA链（3 5外切核酸酶活性）。3、从5端水解DNA链（ 5 3 外切核酸酶活性）。 用蛋白水解酶将DNA聚合酶作有限水解，可得到分子量为68 kDa和36 Kda的两个片段。 大片段（68KDa，也叫Klenow片段） 在体外它可以催化合成反应。 Klenow片段C端的2/3片段具有聚合酶活性，而N端的1/3片段具有35外切核酸酶活性。 两个活性位点的距离为3 nm，表明碱基的加入和去除功能在空间上是

14、分开的。 小片段（35 KDa） 有53外切核酸酶活性，可以切除少的核苷酸。 该酶片段在切除由紫外线照射而形成的嘧啶二聚体中起重要作用。 DNA的半不连续合成中，岗崎片段5端RNA引物的切除可能也依赖于该外切酶活性。 小片段的外切酶活性和大片段的聚合校对功能协同作用，使DNA聚合酶具有从切口处起始复制的独特功能。 在双链DNA的磷酸二酯键断裂（nick）处，DNA聚合酶可延伸3末端，合成新的DNA片段后，置换双螺旋中已有的同源链（切口移位）。体外的切口移位（nick translation）是实现在DNA分子上引入放射性标记核苷酸的重要技术。DNA聚合酶 DNA聚合酶是一条分子量为120,00

15、0的多肽链。这个酶的活性很低，只有DNA聚合酶的5。 DNA聚合酶也以4种脱氧核糖核苷酸为底物，从5-3方向合成DNA。 DNA聚合酶具有3-5外切核酸酶活性，但无5-3外切酶活性。 DNA聚合酶在DNA的修复中起一定作用。DNA聚合酶 DNA聚合酶是真正负责大肠杆菌细胞内合成DNA的复制酶。 DNA聚合酶是多亚基组成的蛋白质。 DNA聚合酶全酶由、和10种不同的 亚基组成。 DNA聚合酶至少含有3种重要的酶活性。 即53DNA聚合酶活性、35外切核酸酶活性和依赖DNA的ATP酶活性。 DNA聚合酶不具有53外切核酸酶活性。 DNA聚合酶全酶在细胞中的含量很少，在每个细胞中只有1020个拷贝的

16、全酶（holoenzyme）。DNA聚合酶含有以下4个不同的功能组分：1）核心聚合酶（core polymerase）核心聚合酶由、三种亚基组成。亚基具有5-3方向合成DNA的催化活性。亚基具有3 -5外切核酸酶的校对功能，控制复制的忠实性。 亚基与亚基形成一个紧密的1：1复合物，协同发挥作用。亚基促进亚基的作用。2）二聚体 亚基是以二聚体的形式存在的。 二聚体是环状的，环绕着DNA并在DNA自由滑动，构成一个滑动钳。 滑动钳可以把全酶束缚在模板DNA上，从而保证高度的进行性。钳的存在对于大肠杆菌的高效复制是十分必要的。3）复合物复合物含有5种不同的亚基，形成一种化学计量为21111的结构。复

17、合物是滑动钳的载体，它可以帮助滑动钳结合到DNA上。复合物有依赖DNA的ATP酶活性。二聚体自己并不能组装到DNA上，它是通过复合物与ATP协同作用催化ATP的水解而组装到DNA上的。复合物是一个不对称的结构，它们相对两个核心聚合酶不对称分布使全酶具有不对称结构，导致在全酶上两个核心聚合酶功能上的不对称性。两个聚合酶功能上的不对称性将使DNA两条链合成表现出不同的性质。4）二聚体 连接蛋白（2）可结合两个核心酶分子和一个复合物。 亚基是一个依赖于DNA的ATP酶， 二聚体可结合两个核心酶，每个亚基结合一个核心酶。 在一个分子结构中存在两个聚合酶表明复制性的聚合酶成对起作用，协同复制双螺旋DNA

18、的两条链。DNA聚合酶全酶的功能是复制大肠杆菌的染色体。DNA聚合酶与DNA聚合酶的不同之处： DNA聚合酶具有多亚基的结构。 聚合反应需要ATP的存在。 反应有很高的速度和高度的进行性。 2 DNA复制的忠实性复制过程的忠实性是保证生物体遗传信息准确传递的一个必要条件，它取决于碱基配对的专一性。DNA聚合酶可以通过两种方式提高互补碱基选择的专一性。第一，通过专一性识别使即将加入的碱基与模板的碱基严格互补，这种方式用来控制合成前的错误。第二，当发现存在着错配碱基时，可切除新加入的碱基，这种方式叫校对控制。两种方式既可单独起作用，也可共同起作用。可见，复制过程中碱基配对受双重核对作用控制：聚合酶

19、的选择作用和35外切核酸酶的校正（proofreading）作用。不同的聚合酶以不同的方式处理聚合与校对的关系。DNA聚合酶在复制过程中造成的错误除了不正确配对造成的核苷酸取代外，还包括由于插入或缺失额外的核苷酸造成的框架移位。 3 其他生物的聚合酶 噬菌体也编码DNA聚合酶，它们是T4、T5、T7、SPIO1。这些酶都有5-3合成酶活性和3-5外切校正活性。 真核生物中发现了5种不同的DNA聚合酶，分别为、。 、位于细胞核中，而是线粒体酶。 4 DNA聚合酶的引物DNA聚合酶的一个共同特征是它们只能催化脱氧核糖核苷酸加到已有核酸链的游离3OH上，而不能从游离核苷酸起始DNA链的合成。DNA聚

20、合酶需要引物来提供3OH末端，然后在其上加入核苷酸来延伸DNA链。通常细胞先在模板上合成一段RNA序列，然后通过DNA聚合酶延伸RNA链的3OH。The first line of evidence supporting RNA priming was the finding that replication of M13 phage DNA by an E. coli extract is inhibited by the antibiotic rifampicin. This is a surprise because rifampicin inhibits E. coli RNA pol

21、ymerase, not DNA polymerase. The explanation is that M13 uses the E. coli RNA polymerase for its DNA synthesis.Perhaps the best evidence for RNA priming was the discovery that DNase cannot completely destroy Okazaki fragments. It leaves little pieces of RNA 10-12 bases long.In 1985, Okazakis group f

22、ound that the intact primers are really about 10-12 bases long. These workers used mutant bacteria that lacked ribonuclease H or the nuclease activity of DNA polymerase I or both. 5 DNA聚合酶催化的分子机制 来源于病毒、原核生物和真核生物的聚合酶、反转录酶甚至RNA聚合酶的聚合酶区域都有一个类似手指、手掌和拇指的基本结构，存在相似的折叠结构。通过晶体结构和模型研究发现， 手指区域可与未复制的单链模板相互作用，同时手指区域的一部分也参与结合进入底物dNTP。 拇指亚区可与模板引物DNA双螺旋相互作用。 聚合酶通过保守的氨基酸残基与引物模板复合物相互作用使引物的3末端定位在手掌和手指的会合点，并与dNTP相对。研究还发现，dNTP的进入伴随着两个Mg2离子的作用，由此提出了核苷酸加入（聚合）反应的双金属离子机制（two metal-ion mechanism)。核苷酸的掺入是受模板指导的，所以DNA聚合酶在每个催化循环中都要改变它的核苷酸