色谱在药物分析方面的应用

1、色谱在药物分析方面的应用色谱在药物分析方面的最新研究进展张鹏鹏，王凌云，张斌浩 (浙江工业大学化材学院工业催化)摘要：现在药学的迅速发展促进针对药物及其代谢产物在过程的不断 深入研究中，建立了许多新的、巧妙、精确而有快速的色谱分析方 法。包括亲水作用色谱固定相在药分离中的应用，薄层色谱法在药物 分析中的应用，液相色谱串联质谱法，脂质体电动色谱。这些方法的诞生使得当代生物医学与中医学理论能够兼容。本文综述了这些色谱方法的具体应用过程及其特点。关键词：亲水作用色谱 薄层色谱法 串联质谱法 脂质体Thelatestchromatographicanalysisresearchindrugresear

2、chPengp engZhang,LingyunWang,BinhaoZahng( ZhejiangUniversityOfTechnology,IndustryCatalysis ) Abstract:Nowwiththerapiddevelopmentofpharmaceuticaldrugsand theirmetabolitesforthecontinuousin-depthstudyoftheprocess, scientistshavecreatedmanynew,preciseandrapidchromatographic methods.Includingtheusingofs

3、eparatingdrugswithstationarypha seofhydrophilicinteractionchromatography,thinlayerchromatog raphysusingindruganalysis,chromatographytandemmassspectrometry,liposomeelectronicchromatography.Allthesemethodsmakethe contemporarybiomedicalandChinesemedicinetheorycanbecompatib le.Thispaperreviewsthesechrom

4、atographicmethodsspecificappli cationsandtheircharacteristics.Keywords:hydrophilicinteract ionthinlayerchromatographymassspectrometrychromatography liposomeelectronicchromatography1 弓| 言色谱工艺歼拓系统从 1996年推出至今的十几年中，结合新的反相介质和新型凝胶介质已 在天然药物活性成分研究和分离中获得了应用。对分离具有活血化瘀的活性成分多种黄酮、抗炎作用的紫草中的 萘醍等的应用咀及用于心血管治疗的银杏叶活性成

5、分银杏总黄酮、 银杏黄酮醇甙及银杏内酯的分离和生产取得了成果。目前在其他活性成分的研究、分离和生产中的应用正在不断发 展之中。随着药物的迅速发展，对药物的检测方法及其分离工艺的开发 研究也越来越吸引更多的人去研究，并且取得了一系列成果。近十几年发展起来的生物膜色谱技术对在药物与生物膜的相互 作用方面的研究进展展现了其在医药研究的广阔应用前景。传统的药物筛选在动物模型上完成，劳动密集，耗费时间长， 而且只能是小规模筛选。为克服动物模型的种种不利因素，人们一直在努力尝试新的高 效、快速、准确的体外药物筛选方法。中药色谱指纹图谱就其本质而言，应可视为中药（包括单味 药与复方制剂）的一种依赖于不同提取

6、方法所得的活性化学组分的 相对浓度谱，它主要体现了中药的整体化学特征（整体性）。国家药品监督管理局确定将在年全面启动中药色谱指纹图谱来 对我国中药注射液进行质量控制，如何既准确而又不丢失特征信息 地表征和评价中药色谱指纹谱图是目前分析化【1】。学，特别是中药分析化学面临的一个新问题 以下将按照生物 膜色谱及其在药物活性成分分析中的应用，亲水作用色谱固定相及 其在中药分离中的应用，光谱相关色谱及其在中药色谱指纹图谱分 析中的应用，脂质体电动色谱及其评价药物-膜相互作用的应用 4中分析方法。2药物分析分离中的色谱方法2.1生物膜色谱及其在药物活性 成分分析中的应用随着生命科学的发展，各个学科都在相

7、互交叉和 相互渗透中找到了新的发展方向。近十几年发展起来的生物膜色谱技术便是生命科学与色谱学相 结合的产物。目前这一技术已经应【2】、多肽及蛋白与脂双层的相互作用用在 预测药物与细胞膜的相互作用【3】、溶质与蛋白的相互作用、蛋白 的纯化、核酸的分离纯化、异构体拆分、生物膜亲和色谱以及磷 脂的合成【4】等领域，并在固定化酶反应器方面得到了应用。本文主要对这一技术在药物与生物膜的相互作用方面的研究进展做一综述，并力图阐明其在药物活性成分分析中的应用前景。一种新药物的诞生都必须经过药物的筛选即药物活性的评定过 程。传统的药物筛选在动物模型上完成，劳动密集，耗费时间长，而 且只能是小规模筛选。为克服动

8、物模型的种种不利因素，人们一直在努力尝试新的高 效、快速、准确的体外药物筛选方法。目前国际上普遍认可的是采用受体模型和酶模型的高通量筛选 方法，从组合化学合成的大量化合物中筛选出具有生物活性的有效 药物。然而即使这种方法也难以用于成分复杂的药物如中草药的药效分 析。因为中药中各组分间可能存在着药效互补及毒性互消等复杂的相 互作用，药效亦为组合药效，这不是单一受体模型可以完成的。从模拟人体细胞膜对药物的吸收的角度进行药物活性成分的分 析，是近几年药物分析研究工作的新亮点。现在大多数的药物学家相信一种化合物的细胞膜的通透性对于 它的活性起关键作用，因为绝大多数的药物必须进入细胞才能表现 它的活性而

9、且内用药物还必须能透过目标细胞的细胞膜才能起作用。而且药物的活性、毒性、在体内的分布及其它生理过程都取决 于药物在膜上的分配状况【1】。因而考察它的细胞膜的通透性可以作为一种鉴定它是否具有药物活性的可靠而快捷的检测方法。在生物膜色谱技术出现之前，人们通过测定药物在有机溶剂水 系统（如辛醇水）及反相液相色谱系统（如以十八烷基硅胶为固定 相）中的分配系数4或者以单层小肠绒毛细胞及小鼠的小肠为模 型来考察药物的被动吸收情况。前两种模式简单易行，但都只能模拟药物在膜上的疏水作用， 而无法模拟磷脂的极性头部与药物的相互作用，以及药物透过细胞 间隙进入人体的吸收过程。90年代初开始，人工培养的单层小肠绒毛

10、细胞做为研究药物的 小肠吸收过程的模型开始受到人们的关注。Artursson等人曾对这一领域的研究进展情况做过专门的【5】。这一种模型比前两种模型具有更好的生物相关性，但因涉及到 绒毛细胞的培养过综述程使操作难度较大。寻找简便且生物相关性好的新模型便成为研究药物吸收的一个 方向。生物膜色谱用于药物活性成分的研究还刚刚起步，已被考察的 药物品种还很少，也只是模拟了药物通过细胞膜的被动运输过程， 分离对象也都是单一的已知样品或几种已知样品的混合物。由于药物在生物膜上的输运过程是药物体现其生物活性的关键 步骤，因而药物在生物膜固定相上的保留行为从一定程度上可以反 映药物的生理活性，所以从理论上说生物

11、膜色谱不仅可以用来评价 单一组分药物的生理活性，也必将在从复杂药物如中草药中筛选活 性成分方面大有作为。由于这种筛选方法具有生理学意义因而可能为药物的药理研究提 供一定的帮助。这就意味着药物活性成分的筛选和活性评价将是生物膜色谱技术 的一个重要的应用领域。我们知道生物膜除含磷脂外，其主要成分还有蛋白质，而且不 同功能的细胞其细胞膜中脂的组成也有区别。一般来讲蛋白的含量与膜的功能有关，功能越多越复杂，蛋白 含量就越多，因而模拟生物膜应考虑蛋白质的影响。另外约占生物质膜重量2%-10%的糖类分子在细胞信息识别方面 的功能在近些年也越来越受到普遍地认可与重视，对细胞膜识别功 能的模拟研究也正在进行中

12、。而且药物透过细胞膜的途径远不止被动扩散一种，还包括载体 蛋白参与的协助扩散、需消耗能量的主动运输等多种形式。但这些方面的工作还未见用于考察药物与膜的相互作用。因而生物膜色谱技术的发展应在跟踪色谱技术、色谱材料的最新 发展的同时，更密切地关注生物膜模拟技术的最新进展，从而不断 完善现有的色谱模型，使药物与膜固定相作用的色谱过程更接近于 生物体内的自然吸收过程。如此，将该模型用于药物的体外筛选和活性评价便更加有效， 更具实际意义。2.2亲水作用色谱固定相及其在中药分离中的应用反相液相色 谱(RPLC)是当前分离分析和分离制备中应用最为广泛的色谱模式， 其依靠疏水固定相与溶质之间的疏水相互作用实现

13、弱极性和中等极 性化合物的高效分离。但是，RPLC对强极性化合物(如寡糖、糖苷和强极性寡肽等) 的保留很弱，甚至不保留，因此强极性化合物在RPLC上不能得到 很好的分离。用来分离强极性化合物的液相色谱方法主要有离子交换色谱法 (IEC)、正相色谱法(NPLC)和亲水作用色谱法(HILIC)。它们可以作为RPLC的补充用于强极性化合物的分离；然而，它 们又各自存在一定的局限性。HILIC作为一种分离极性化合物的液相色谱模式，其概念最早 是由Pert于1990年提出的。HILIC的主要特征是使用类似于正相色谱的极性固定相和水/有 机溶剂(通常是乙腊)流动相(其中水是强洗脱溶剂)。与正相色谱类似，在

14、HILIC模式下化合物的保留时间随化合物 极性的增强而增加。但是，由于HILIC使用含水流动相，这就可以解决正相色谱中 水溶性物质不溶于流动相的问题。早在1970年代，HILIC的概念提出之前，Linden等旧1就使 用氨基硅胶作为固定相、以含75%乙月青的水溶液作为流动相用于糖 的分离分析。这种分离技术是典型的HILIC模式，也是最早的关于HILIC的 报道，虽然其中并未涉及HILIC的定义。近年来，HILIC越来越受到关注和重视【6】。一方面是因为强极性化合物的分离问题引起了各个研究领域的 重视，如药物分析、代谢组学、蛋白质组学等研究领域都不同程 度地涉及强极性化合物的分离问题；另一方面是

15、由于HILIC具有其 自身的优势。首先，HILIC模式对强极性化合物和亲水化合物具有很好的保 留和分离选择性，是解决各类强极性化合物和亲水化合物分离问题 的可靠手段。其次，HILIC模式使用的流动相体系相对简单，操作方便，而 且克服了 NPLC的流动相对水溶性物质溶解性差、保留时间对流动相 中水含量敏感以及与质谱检测器不兼容等缺点。另外，HILIC的分离机理与RPLC完全不同，两者的分离选择 性有很好的正交性，而两者的流动相体系却相似，十分适合用于构 建HILICRPLC二维色谱系统HO。将其用于多肽等复杂样品的分离，弥补了常用的IEC-RPLC二 维体系的不足，成为解决复杂样品分离问题的有效

16、手段之一。Irgum等对HILIC的分离机理、分离材料和各方面的应用进行 了全面的综述以来，近几年关于HILIC的综述文章逐渐增多，它们 都在一定程度上涉及了 HILIC固定相。但专门针对HILIC固定相进行综述的文章较少。HILIC固定相的主要特征是固定相表面是与水有很好的亲和性的 强极性基团，如氨基、羟基、酰胺基等。早期的亲水作用色谱分离材料主要是原有的正相色谱固定相，如硅胶、氨基键合硅胶、二醇基键合硅胶等【7】。近年来，专门用于亲水作用色谱的分离材料也已出现，其主要 是将含酰胺基、羟基、两性离子等强极性基团的分子键合到硅胶上 作为HILIC分离材料。虽然按照Pert提出的观点，亲水色谱的

17、保留主要是依靠溶质在 固定相表面吸附的富水层与流动相中的分配机理，但是由于溶质与 固定相直接相互作用的存在，不同固定相的保留性质表现出较大的 差异。用HILIC分离技术，以川芎水提物为对象，发展了亲水作 用色谱指纹图谱技术水提物中存在着大量在RPLC上没有保留的强极 性物质，因此在传统的RPLC指纹谱中这些强极【8】。川芎性物质的信息往往被忽略。在亲水作用色谱上强极性物质得到了很好的分离，可作为一种 新的中药指纹图谱，揭示中药强极性物质的组成信息。HIUC指纹图谱技术与传统的RPLC指纹图谱技术相结合，能更 全面地反映中药全成分信息，克服了传统RPLC指纹图谱技术不能反 映强极性组分信息的缺陷

18、，有利于提高中药质量控制的技术水平。2.3光谱相关色谱及其在中药色谱指纹图谱分析中的应用根据相 同的化学物质具有相同的光谱或波谱，在大多数情况下，同一样本 的化学成分在同种类型的色谱柱上保留时间不可能完全相同。但是洗脱的顺序应基本不变，实现不同实验条件下所得的中药 色谱指纹图谱的仪器系统误差的校准是完全可能的。较可靠的方法是依据化学物质的光谱或质谱识别相同组分在不同 色谱中的流出时间，再利用化学计量学方法作相应的组分色谱校准。不同的两个色谱曲线，虽对应的流出组分的保留时间有些差异， 但它们的光谱（或质谱）相同或相似。通过对所有不同流出时间点的光谱相关计算，可得一个类似色 谱的光谱相关系数曲线，

19、作者称之为光谱相关色谱得到了一个由联 用色谱仪，如GC-MS或HPLC-DAD，测得的色谱指纹图谱中的某 一个纯物质光谱，记为Si。事实上，该纯物质光谱可通过对色谱峰进行纯度检验，或通过 选择性区域的确【9】。现设通过某种适当的方法，我们定来获得。为进一步得到相对于另一色谱指纹图谱中该纯物质的光谱相关 色谱，可通过对另一个样本的二维色谱指纹图谱所包含的所有光谱， 即其每一个保留时间点所对应的光谱，记为（1， ，m），来计算 它们与该目标纯物质光谱的相似系数。这样，我们所得到的将是本文所定义的相对于该目标纯物质的 光谱相关色谱。在实际的运算中，对二维色谱指纹数据矩阵的每一行Xi都计算 出与该目标

20、纯物质光谱的相似系数即可。根据光谱相关系数的大小，我们就可识别出不同实验条件下所 得的中药色谱指纹图谱中同一化学物质对应的流出组分，而勿需具 体鉴定该组分为哪种化学物质。继结合目标纯物质光谱所在的原色谱峰簇的保留时间信息，正 确判断其准确的峰位置，以实现中药色谱指纹图【10】。谱的仪器系统误差的校准2.4脂质体电动色谱及其评价药物-膜相互作用药物的吸收、分布、代谢及排泄等都涉及到跨生物膜的转运。药物要发挥疗效，其在生物膜中的通透性是一个不可忽视的重 要因素，而药物与生物膜的相互作用反映了药物的膜通透性。新药研发过程中，动物试验的高代价及伦理学上的问题使得其 他体外模型应运而生，包括细胞技术、磷

21、脂膜色谱 (ImmobilizedArtificialMembraneChromatography， IAMC)、 微孚 电动色谱(MicrolusionElectronicChromatography，MEEKC)及生物 分配胶束色谱(BiopartitioningMicellarChromatography， BMC)等【11】。这些模型作为新药研发初期药动学筛选工具各有其优缺点。众所周知，所有生物膜都具有基本相同的结构和性质，两亲性 的磷脂是生物膜的主要组成部分，因此相比于其他模拟生物膜的聚集体如胶束、微乳等，液晶态脂质体的本质属性更接近于生物膜。目前，以脂质体模拟生物膜的体外模型有脂质

22、体/水系统和固 定化脂质体液相色谱(immobilizedliposomeChromatography, ILC), 国外研究报道较多，主要用于测定药物的亲脂性并预测药物的小肠 吸收等。但用这些方法模拟生物膜时存在测定繁琐或色谱柱不易制备等问 题。借助毛细管电泳高效快速的特点，将脂质体溶液加入到毛细管 中作为运行溶液。脂质体作为一个假固定相，药物的迁移行为反映了其与脂质体 的相互作用， 称之为脂质体电动色谱 (liposomeelectrokineticchromatography， LEKC)。LEKC作为一种分析技术，并不具有特别的优势，但用于 研究药物与生物膜的相互作用却是一个强有力的工

23、具。与正辛醇/ 水系统(noctanol/ water， O / W)， IAMC 和 ILC 这些模型比较，LEKC有如下明显的优势。脂质体的双层磷脂结构更接近于细胞生物膜结构，相比IAMC 中固定单分子层磷脂，脂质体能更好地模拟生物膜脂质双层的流动 性。LEKC快速、简便及样品量少，对样品纯度没有很高的要求。而应用脂质体/水系统(1iposome/ water)的电位滴定、固相 萃取和透析等测定方法步骤繁琐或耗时。应用LEKC研究药物与生物膜相互作用可以在不同实验室之 问建立普遍一致的分配系数尺度。在IAMC中保留因子矗依赖于药物分配于固定相及流动相的相体 积比，所以不同色谱柱的相体积比，

24、妨碍了建立一种实验室之间可 重现的定量药物一膜相互作用的尺度参数，这是IAMC的主要缺点。而在LEKC中中可以计算，并且西不随仪器、毛细管的改变而 改变。在LEKC中，可以通过调节磷脂种类、组成比例等模拟其他 生物膜，如血脑屏障等，甚至通过在脂质体中嵌入蛋白以寻找具有 特定作用的生物活性成分。与复杂的生物系统比较，LEKC是可严格控制试验操作条件、重 现性好的色谱体系，其突出优点是具有很强的分离能力，对样品没 有纯度要求，并且可以分析复杂样品，特别适用于中药复杂体系。另外，简单、快速、微量及易实现自动化等优点，使其成为 药物膜通透性及活性高通量筛选的理想选择，特别适用于新药研发 初期大容量样品

25、的快速筛选。3展望色谱工艺歼拓系统从1996年推出至今的几年中，结合新 的反相介质和新型凝胶介质已在天然药物活性成分研究和分离中获 得了应用。特别是质谱色谱【12】的连用，大大扩大了色谱的适用范围和 分式的简便性。对分离具有活血化瘀的活性成分多种黄酮、抗炎作用的紫草中 的萘醍等的应用咀及用于心血管治疗的银杏叶活性成分银杏总黄酮、 银杏黄酮醇甙及银杏内酯的分离和生产取得了成果。目前在其他活性成分的研究、分离和生产中的应用正在不断发 展之中。我们相信，色谱工艺开拓系统及新的色谱介质随着开拓系统与 高速逆流色谱(Hi 小 SpeedCounterCurrentChromatography，HSCCC) 联用技术的发展，将使民族药活性成分的研究、分离和生产提高到 一个新的水平。参考文献：【1】XiePeishan.ChineseTraditionalPatentMedicine,2019,22(6):391- 394【2】王柯，胡青，崔益泠，等.液相色谱.离子阱 质谱联用检测减肥类中药及保健食品中28种非法掺加药物的研究 J.药物分析杂志，2008，28(8)：1268.1275【2】PidgeonC,OngS,LiuH