色谱方法验证审评指南

1、色谱方法通常用于原料、药物、药物制剂和生物体液中化合物的定性和定量。涉及的成分包括 手性的或非手性的药物、过程杂质、残留溶媒、附加剂如防腐剂、分解产物、从容器和密闭包 装或制造过程中带入的可提取和可过滤的杂质、植物药中的农药和代谢物等。试验方法的目的是得到可信赖的和准确的数据，无论是用于验收、出厂、稳定性或药物动力学 研究。得到的数据用于药品开发或批准后的定性和定量，试验包括原料的验收、药物和药物制 剂的出厂、过程检验（In- process testing）的质量保证和失效期的建立。方法的验证是由药品的开发者或使用者来检验其方法是否达到预期的可靠性、准确度和精密度 的过程。得到的数据成为方法

2、的验证资料的一部分交给CDER.。方法的验证对于完成机构满足档案要求不是一次性的，开发者和使用者都应验证其方法的耐用 度或耐久性（ruggedness or robustness.），其他的分析者、用其它相当的仪器，在其它的 日期或地点，在药品生产期限（有效期）全过程，方法都应能够重现。如果产生数据的方法是可 靠的，那么所得到的验收、出厂、稳定性或药物动力学的数据就是可信赖的。验证的过程和方 法的设计应在开发过程中重要的数据产生之前，如果方法改变了，还应该再验证。色谱是一种技术，通过该技术，样品中的组分载入液相或气相中，通过在固定相上由吸附一解 吸附来完成。高效液相色谱（HPLC）HPLC分离

3、是基于在样品在流动相液体和固定相之间的不同分配。一般地说HPLC大体分为以下 几种（未考虑其重要性顺序）手性液相色谱离子交换色谱离子对/亲和色谱正相色谱反相色谱分子排阻色谱手性液相色谱分离光学异构体可在手性固定相上，用衍生化试剂或在非手性固定相上用流动相添加剂形成非 对对映体来实现。用作杂质试验方法时，如果光学异构体杂质在光学异构体药物之前洗脱，要 增加灵敏度。离子交换色谱分离基于荷电功能团，样品负离子（X -）为阴离子，样品正离子（X + ）为阳离子，一般用pH 程序洗脱。离子对/亲和色谱分离基于与目标样品的专一的化学相互作用。更普遍的反相型用缓冲液和加入的对离子（与被 分离的样品荷相反电荷

4、）分离。分离受pH、离子强度、温度、浓度和共存的有机溶剂类型的影 响。亲和色谱，一般用于大分子，使用配合体（共价结合在固体基质上的生物活性分子），与 其同类的抗原（分析介质）反应，生成可逆转的复合物，通过改变缓冲条件洗脱。正相色谱正相色谱为用有机溶剂为流动相和极性的固定相。此时较小极性的组分比较大极性组分更快地 洗脱。反相色谱报给CDER的最通常的实验方法是反相HPLC方法，最通常用紫外检测器。反相色谱，一种键合相的色谱技术，用水作基本溶剂，选择性也受溶剂强度、柱温和pH的影 响，一般来说较大极性比较小极性组分洗脱更快。紫外检测器可以用于所有色谱，这类检测器要注意的是灯老化后的灵敏度降低，其灵

5、敏度因（仪器）的设计和/或者制造厂家的不同有小的变异。需要指出，用紫外检检测器和反相HPLC组 合得到的色谱图不一定能真实的反映事实，原因是：极性比目标化合物大得多的化合物可能被掩盖（在溶剂前沿或死体积时同时洗脱）。极性比目标化合物小得多的化合物洗脱出来晚，甚至保留在柱上。紫外吸收系数较低和最大吸收不同的化合物在检测相对较低浓度的目标分析物时不能被检 出，因为通常只有一个检测波长。排阻色谱也叫凝胶渗漉（permeation）或滤过，分离基于化合物分子大小或水动力学（hydrodynamic）容 积。比多孔柱填料孔径大得多的分子最先洗脱，小分子进入孔隙洗脱晚，其余的洗脱速率取决 于其分子的相对大

6、小。气相色谱（GC）气相色谱基于挥发性样品由作为流动相的载气运载，通过色谱柱内的固定相时发生吸附和解吸 附过程进行分离。通常气相色谱分析的样品是低分子量化合物，这些化合物是易挥发的和高温时稳定的。在这一 方面，药物和药物制剂中的残留溶剂适于气相色谱分析。生成化学衍生物可达到易挥发和热稳 定的目的。常用的检测器是用于含碳化合物的火焰离子化检测器（FID），用于卤代化合物的电子捕获式 检测器（ECD），用于含硫和含磷化合物的火焰光度检测器（FPD），以及用于含氮或磷化合物 的氮磷检测器（NPD）。气相色谱也能实现手性分离。填充柱迅速被毛细管取代来改进分离度 和分析时间，在气相色谱上分析物位置与HP

7、LC 一样，用保留时间（Rt）表示。薄层色谱（TLC）薄层色谱是一种最简便普通的色谱技术，分离基于在一端浸于溶剂混合物（流动相）中的薄层 板（固定相）上点的样品移动进行分离，整个系统在密封的缸中进行。对于本身没有颜色的化合物，检出技术包括荧光、紫外和喷雾显色剂（通用的和专一的）。分析物在薄层板上的位置用Rf值来表示，Rf值为化合物的移动距离与溶剂前沿的比值。三种方法，气相、液相和薄层中，薄层色谱是最普通的试验方法，因为薄层板上所有的组分都 可用适宜的检测技术检出。然而通常不如HPLC那么准确和灵敏。虽然选用适宜的检测技术， TLC法能见到分析的“全图”（whole picture），但比HPL

8、C分析变异较大。.参考标准品（对照品）参考标准品为经充分鉴定的高纯度化合物，色谱方法更大程度上依赖参考标准品来提供准确的 数据。因而参考标准品的质量和纯度是很重要的，有二类参考标准品，化学的和放射性的。后 者应考虑放射标记纯度和化学纯度。按照提交方法验证的样品和分析数据，指南中的二类化学参考标准品如下：-USP / NF参考标准品，不需要鉴定。-非总目录标准品，应用合理方法制备，并经充分鉴定，以保证其鉴别、含量、质量和纯度 达到最高。应该指出-大多数USP / NF参考标准品未标示化合物纯度。-对非USP参考标准品，提出纯度的校正数应包括在试验方法的计算中。-提供的参考标准品中没有以下杂质，诸

9、如合成过程的结构相似的杂质和其它的过程杂质， 如重金属、残留溶剂、水分（结合的和非结合的）、植物来源制剂中的农药和分解产物等。-如果在方法中规定，用前参考标准品要干燥除去残留溶剂、非结合水分和有时是结合水（取决于干燥条件），对易潮解的化合物总是包括干燥步骤的。但另一方面干燥可能导致结晶 水的损失或引起热敏感化合物的降解。色谱方法用外标法和内标法进行定量。外标法当参考标准品与样品在不同的色谱图上进行分析时，用外标法。定量基于样品的峰面积/高 （HPLC或GC）或强度（TLC）与分析对象、参考标准品的比值。更适合用外标法的样品如下：样品具有单一的目标浓度和狭窄的浓度范围，例如验收和出厂检验。简便的

10、样品制备操作。增加走基线的时间，为检测可能的额外峰，如杂质试验。内标法加入一种已知纯度并且在分析中不产生干扰的化合物至样品混合液中，定量基于被分析的化合 物与内标的响应比值与参考标准品得到的比值进行比较。这一方法很少用于TLC。更适合用内标法的样品如下：复杂的样品制备过程，如多次提取。低浓度的样品（灵敏度是确定的），如药代动力学的研究。在样品分析中预计是很宽的浓度范围，如药物动力学研究。虽然CDER不规定方法应该用内标或外标法用于定量，但一般的看法是用于验收、稳定性和TLC用外标法，对生物体液和GC用内标法。工作浓度为方法中规定的被分析对象的目标浓度。保持样品浓度与标准的浓度相近可以改善方 法

11、的准确性。建议如果参考标准品的纯度校正因子已知，那么在计算中应该包括。在方法中要规定标准品和样品的工作浓度。2005-2-13 8:24:00 IP:60.55.40.250主题：RE:分享色谱方法验证审评指南（转贴）查看该用户在资料中心上传的资料个人资料给他留言帖子合集回复引用维护.药物和药物制剂HPLC验证的参数虽然许多种HPLC都可采用，但最普遍上报的方法都是用紫外检测器的反相HPLC法，以此作为 验证参数的例子。这一方法验证的规定可以扩展到其它检测器和其它色谱。对于验收、出厂或 稳定性试验，准确性应最佳化，因为要表明实测值和真值的差异是最为关注的。准确性准确性是衡量测量实验值和真值的接

12、近程度。推荐药物和药物制剂的准确性研究在标示量的 80%、100% 和 120% 的水平上来进行的，这与 “The Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for method Validation ”的规定是一致的。对于药物制剂，准确性试验通常是将已知量的药物按重量或体积（溶于稀释剂）以分析对 象检测浓度的线性范围量加到空白处方内来完成的。对于液体制剂，这是真实的回收率；而对 于诸如片剂、栓剂、透皮吸收制剂等，这不能检测稀释剂中的赋形剂与活性成分间可能产生的 作用。实际上要做一个已知活性药物量的单个剂量单位（single un

13、it）来进行回收试验是困 难的。准确性试验评价在赋形剂存在时，在分析药物制剂的色谱条件下，试验方法的专属性。 但这只是样品制备过程和色谱过程中的回收率，而不是制造过程的影响。在每个推荐检测浓度重复进样，其重复进样的RSD提供了分析方法的变动性，或是试验方法的 精密程度。重复性的均值以标示量的来表示，这表明试验方法的准确程度。建议回收试验在每个水平上（标示量的80%、100%和120%）至少做3份，均数用来估计准确性的， RSD是估计样品分析精密度的。检出限和定量限这些限度通常用于药物和药物制剂中有关物质的测定。限度的规定连同药物和药物制剂出厂和 稳定性有关的调整杂质量的方法一起要上报。检出限度

14、是样品中分析对象在实验条件下可被检出的最低限度，但不要求定量。定量限度是样 品中分析对象在实验条件下，以可接受的精密度和准确性定量测定的最低浓度。使用UV检测器时，保证低浓度化合物的检测精密度是困难的，这是由于检测器的灯随着寿命 的延长可能逐渐减小其灵敏度，不同检测器制造厂家的躁声水平也不同。在低浓度时，保证每 次试验方法能达到检出限度和定量限度是必要的。指定的杂质无对照品，但是又要保证检出 限，额外峰可能不出现或出现。对评价额外峰检出的可行的粗糙方法是用以分析对象峰面积的 百分比的要求作为检出限。例如检出限要求分析对象峰面积50000的0.01%，那么给出面积 计数为5,则不能检出。虽然US

15、P表示检出限和定量限分别用躁声水平的2或3和10倍表示，但这一概念不是很实际 的。在方法研究阶段，用不同的检测器分析样品时，检测器的躁声水平是不同的。在定量限水 平的试验方法中使用对照品（由申报者提供）能保证杂质可被检出和被定量。检测器灵敏度因型号和制造厂家的不同而异，见表1。用二种商用检测器分析一种化合物，这 些数据不应作为二种检测器灵敏度预期的比例。在设定这些限度时，因为还有起部分作用的其 它参数，如灯和柱的寿命，但它们是不知道的。表1二种商用检测器的检出灵敏度限度比较检测器1检测器2定量限度0.21% 0.07%检出限度0.16% 0.05%人们应该注意，基线躁声不应解释为额外峰。如果样

16、品的稀释剂与流动相所用的溶剂不同（比 例或类型），亦可能在死体积处见到波动。如果有目标化合物的参考标准品，那么要使用接近定量限的或按规定配制的标准溶液。记录没 有参考标准品的杂质峰时，推荐使用药物的稀释液作为参考标准溶液。然后对方法要进行校 正，测定的高低浓度都要在药物检出线性范围内，否则用相同色谱图下面积或峰高的表示是 有偏差的。应该注意得到的用面积计数的额外峰不能被认为是取决于该化合物UV吸收系数或 吸收度的检出响应。建议分析重现性和进样重现性数据应在定量限度范围内。在试验方法的定量限的浓度处，用一外加的参考标准溶液。线性符合比耳定律的可检出的线性范围取决于被分析化合物和所用的检测器。工作

17、样品的浓度和准 确性试验样品的浓度应在线性范围内。图1和2表明UV响应和浓度的（a）线性和非线性关系。有一点应该注意，当记录杂质峰时 （用母体药物的面积表示），如果使用非线性的浓度曲线部分，观察到的杂质可能不是理论 计数的真实反映。另外，仅当杂质和母体化合物的吸收系数或吸收度值相同时才能得到真实的 量。杂质参考标准品通常是必需的。建议检测的线性范围取决于试验方法的目的，用于含量测定方法的推荐范围为不得过土 20%，以峰 面积%计的测定杂质的范围是目标浓度的+20%，低至药物或杂质的定量限。在大多数情况下， 回归系数要0.999,截距和斜率应标明。精密度精密度为在相同分析条件下的一组测量值相互接

18、近的程度。ICH定义精密度含有3个部分，即 重复性（repeatability ）组间精密度（intermediate precision ）和重现性（reproducibility ）。在 USP 1990，1225 页中的耐用度（ruggedness ）具体体现在这一指 南的组间精密度，重现性和耐久性（robustness ）概念中。重复性a. 进样重复性灵敏度是检出样品中分析对象浓度小量的变化的能力。灵敏度可以通过系统适用性试验中的进 样重现性的规定来部分的控制。多次注射均一样品（制备的溶液）测量的灵敏度和精密度，表明在色谱条件下测定当天HPLC 仪器的性能。这一信息作为验证数据和系统适

19、用性试验的一部分。以百分变异系数（CV%）或 相对标准偏差（RSD）的规定来测定其分析的变异限度。值越接近人们可以期待结果更精密或 对结果的变化更灵敏。这是假设在系统适用性试验后色谱仪功能未失常的情况下的。然而要注 意这不是考虑由药品制造和实验室样品制备引起的变异。作为进样和R t的变异的例子，表2 提供了在进样过程中色谱系统漏液时收集的数据。四个重复的样品分别进样，注意其峰面积的 变异和保留时间的漂移。从性能良好的系统得到的一组典型数据见表3。表2进样中色谱系统系统漏液时的重复性数据样品R t峰面积AR t峰面积A1A2 5.625.66 21556992120466 0.04 35233B

20、1B2 5.876.13 22056592288355 0.26 82696C1 C2 6.216.48 22270662265279 0.27 38213D1 D2 6.736.99 25818882602016 0.26 20128表3色谱系统功能正常时的进样重复性数据剂型N均数土 SD RSD吸入溶液 10 1993162 5029 0.25%吸入用溶液 10 1722253 6288 0.37%胶囊 10 1744320 3133 0.18%建议作为方法验证的一部分，建议最少10次进样，RSDW1%。对于药物或药物制剂中的活性成分出 厂和稳定性研究，其RSDW1%。系统适用性试验的精密度RSD至少5次进样。对低浓度杂质， 较高的变异系数可以接受。b.分析重复性分析重复性由同一分析者在相同的实验条件下进行的多次测量，用RSD表示。实际上，它常常 与准确性一起进行研究，见.A部分准确性项下。组间精密度组间精密度以前作为持久稳定性的一部分。该数据用来评价在与方法研究过程不同的条件下的 方法可靠性。目的是保证同样的样品在方法研究期后进行分析能得到相同的结果。取根据时间和条件，方法可以在多天、多个分析工作者和多台仪器上试验。良好的系统适用性试验规定可以部分地保证试验方法的组间精密度。因此设定严格的但实际的 系