实验室中文版原位杂交

1、精选优质文档-倾情为你奉上精选优质文档-倾情为你奉上专心-专注-专业专心-专注-专业精选优质文档-倾情为你奉上专心-专注-专业In situ hybridization final edition第一部分：1 固定（第一天，下午）用DEPC水配制8%多聚甲醛（粉末）（作为储备液，4C可保存1月）：多聚甲醛（粉末）8g，溶解于100ml DEPC水中，60C孵育30min（此时多聚甲醛不溶）；加入10N NaOH 15ul，调节pH值于7.4左右，用手振荡，多聚甲醛将快速溶解；用8%多聚甲醛储备液和PBS缓冲液配制4%多聚甲醛：8%多聚甲醛储备液50ml、10PBS（DEPC配制）10ml、DE

2、PC水40ml（4%的多聚甲醛作为工作液在1周内使用）；将组织块放置于10体积的4%多聚甲醛溶液中固定1-2h（室温），其间缓慢摇动，4C放置过夜（16h，其间缓慢摇动）。注意：固定时，一定要保证多聚甲醛和材料中水分的充分交换，否则会造成材料不能很好固定！2 脱水（第二天，早晨）：按下列顺序对材料进行脱水：1 PBS (DEPC) 5min 2次70%乙醇(DEPC) 5min 80%乙醇(DEPC) 5min90%乙醇(DEPC) 5min100%乙醇 5min (脱水时间应随组织的体积大小适当变化)100% 乙醇 -30C过夜！注意：脱水时间的长度长一点不会对材料造成太大影响，但若脱水时间

3、不够，用二甲苯透明的时候会让二甲苯浑浊，不能进行很好的置换，直接影响包埋效果！3包埋（包埋的时间依据材料的大小而定）：将材料转移到100%乙醇中，室温放置 15min；再次在100%乙醇中放置 10-15min；100%乙醇/二甲苯 30min二甲苯浸泡 30min2次；注意：二甲苯浸泡时间不确定，依据为材料透明即可。如若透明时间过长，会使材料过脆，包埋好的材料在切片时会破碎！二甲苯/石蜡 30min石蜡 30min 石蜡 40min根据常规包埋方法进行包埋。注意：包埋过程中，二甲苯一定要脱干净，否则也会使材料变脆！因此在III蜡中放置的时间可以酌情延长，依据材料的体积而定。Note：组织过大

4、，二甲苯未能使材料内的部分透明，切片时，此处材料会脱落，造成空洞。可否考虑100%乙醇/二甲苯浸泡时间稍微延长！？4 组织切片：注意：切片材料为全鱼或者去除内脏的幼鱼片段时，骨骼（尤其是脊柱）会损伤切片刀片，造成切片脆裂或者切痕，在展片时，材料会破裂。因此，在切片时，一旦发现材料破碎或者出现刀痕，必须将切片刀片横移，避开刀片缺口！切片厚度应为5-8um；应同时准备一些该材料的组织切片用于HE染色；组织切片时为避免RNase污染，应保持使用无粉手套和DEPC水，切片完全干燥后应保存于4C。贴片，展片：所用已经coating的玻片一般只使用远离书写端1/3处。一来可以节约随后步骤中使用试剂的量；二

5、来节约切片材料；三便于封片。展片时，先用滴管将DEPC水在靠近1/3处涂抹很薄一层液体，将弯钩解剖针挑取单张材料切片（尽可能切割整齐）放于液面（此时，材料将浮于液面，注意不要将切面朝上！），用滤纸将远端多余水分吸去一部分（以免过度展片），放置3-5行（视材料宽度而定），于39-42C的展片机上展片。Slide cleaning：5% Decon 90清洗1h，自来水冲洗2h，蒸馏水冲洗数次并在200C干燥8h，并用手套将玻片放置于玻片盒中，保存于4C。Poly-L-Lysine coating:用10mM Tris-HCl 缓冲液（pH8.0）配制50ug/ml 多聚赖氨酸溶液，并向无RNas

6、e的玻片上滴加多聚赖氨酸溶液，37 干燥24 h。第二部分 探针制备:将目的基因的cDNA或ORF插入到pGEM-T Easy载体（Promega，或者其他带有T7和SP6 RNA聚合酶结合位点的载体），提取质粒DNA，并测序验证；测序验证后，挑选含所需插入方向的质粒，用T7和SP6结合位点外围的前后引物扩增包含T7和SP6结合位点和目的片段的线性DNA；PCR产物的纯化和定量；0.5-1ug PCR产物用于T7和SP6的体外转录（制备探针）：T7的转录效率比SP6高，一般用T7合成反义链，而SP6合成正义链探针；如果可能，直接将欲作为合成探针的模板克隆入pGEM-T载体中，然后通过PCR合成

7、转录模板。克隆入普通亚克隆载体（如：pMD-19T）中，然后 用T7-M13和SP6-M13-引物成模板后，转录的效果不是太好！0.5-1ug PCR product? l10X DIG RNA labeling mix2 l10X Transcription buffer2 lT7 or SP6 polymerase (20U/l)2 l（共40U）RNase inhibitor (40U/l)1l（共40U）DEPC DW? l总体积20 l混合并离心;37C温育2-3h；加入DNase I (RNase free) (10U/ul) 2ul，混合并离心；37C温育15min；加入50ul

8、 100% 乙醇 (2.5体积), 2ul (1/10体积) NaAC；涡旋混匀，在-20C 放置2-6h或者过夜；4C，14000rpm离心30min；用70% DEPC乙醇洗一次；4C，14000rpm离心15min；移去乙醇并室温放置5min使乙醇挥发；加入50 ul DEPC水和1ul RNase 抑制剂； 使用前测量 RNA 探针浓度（Sp6, 100ng/ul; T7, 400ng/ul）探针可在-80C 保存 1月化将目的片段/ORF插入到pMD-19T载体中，挑选一定插入方向的克隆，用T7-M13和SP6-M13-引物扩增目的片段，使其带上T7和SP6的启动子序列。电泳纯后，作

9、为RNA探针合成的模板！一张用于原位杂交的切片一般需要加入200ul左右的探针！注意：这种方法合成出的模板，是否能很好合成RNA探针，还需要深入的证明！第三部分：in situ hybridization第一天：杂交同时准备正义探针（T7）和反义探针（SP6）。复水二甲苯 5min3次（如近期再次实验，试剂可反复利用）100% 乙醇 1-5min2次90% 乙醇 1min80% 乙醇 1min70% 乙醇 1min 0.85 X PBS-1 5min0.85 X PBS-2 5min 0.85 X PBS-3 5min37C蛋白酶K 4-10ug/ml (从20mg/ml储备液稀释)处理5-1

10、5min (成鱼卵巢，15min; 幼鱼卵巢，10min；胚胎，稚鱼，精巢5min) (Tilapia幼鱼和成鱼 用蛋白酶K（10ug/ml）处理5min即可Kobayashi!)；0.85X PBS洗5min；4%多聚甲醛在室温中再次固定15min；2mg/ml 甘氨酸(蛋白酶K的抑制剂？从甘氨酸储备液20mg/ml稀释)室温处理15min；0.1M TEA (三乙醇胺) (50% TEA 2.65ml+ 2N HCL 1.05 ml +DEPC 100ml)处理5min (dilute from stock before using)室温；0.25% 乙酸苷/ 0.1M三乙醇胺（用前向0.

11、1M TEA中加入乙酸苷) 10min，(100ml 0.1M TEA+ 250ul acetic anhydride)室温；2 X SSC 5min RT预杂交：66%去离子甲酰胺/2 X SSC，60C孵育1h（在染缸中进行）；本实验时原位杂交一般使用液体体积为70-80ml，高度以刚好淹没材料为准。50 ml 预杂交液:去离子甲酰胺: 33ml20XSSC (DEPC) 5mlDEPC水 12ml60C-65C于杂交缓冲液中杂交14-16hr (湿盒中进行，可在其中加入预杂交液，以保证杂交过程中杂交体系不会干)。然后将湿盒封闭，避免在高温下，盒内湿度下降。一张用于原位杂交的切片一般需要加

12、入200ul左右的探针！(Save probe for re-use if the probe is OK!)Note：所有在高于室温下进行的湿盒中反应，均需将湿盒封闭！Hybridization buffer: Final concentrationto prepare 10mlFormamide60%6ml1.0M Tris-HCL (pH: 8.0)0.02M200ul0.5M EDTA (pH: 8.0)0.0025M50ul100Xdenhardts solution1X100ulNaCl（2.5M）0.3M1.2ml50% dextran sulfate7.5%1.5mlDEPC

13、treated DWX950ulKeep the hybridization buffer at -20CPrepare the hybridization solution: Probe with final concentration 200-500ng/mltRNA (20mg/ml) 1ul/mlHybridization buffer According to the number of your slides Water bath at 80C for 10min to denature RNA probe Load the hybridization solution with

14、probe to slides.第二天：Wash and staining (从这一步开始，溶液可以用蒸馏水进行配制，无需DEPC)Washing（rinse）：1)50% formamide/2XSSC 55C60C 20min 2)50% formamide/2XSSC 55C60C 20min （用20XSSC配置，切勿用2XSSC直接配置！）3)2XSSC 37C 10min 4)RNase treatment RNase/2XSSC 100g/ml (RNase A的浓度应为 10-100ug/ml) (RNase专用湿盒)5)2XSSC 60C 20min 6)0.2XSSC 60

15、C 20min Note: Please increase the time and times of washing if the background is very high.染色:1）DIG1 洗涤 室温 5min DIG1 bufferFinal concentration for 300mlMaleic acid 0.1M 3.48g NaCL 0.15M 2.63gpH to 7.5Add D.W. to 300 mlAutoclave注意：根据罗氏说明书，未稀释抗体保存于4C，可放置至产品失效日期；稀释后的抗体，在4C仅能保存12h。切忌冻存！2）DIG2 封阻(DIG1中加入

16、1% 封阻剂（BSA）) 30min 室温 (Chamber3)3）Anti-DIG-AP is diluted by 50010000 times in DIG2 （最好依据产品说明书稀释2000-5000倍，即使抗体的量较少，也可通过延长显色时间进行调整） 30min 室温 (Chamber3) (稀释后的抗体可重复使用!) 4）DIG1洗涤 15min35）DIG3检测 15min DIG3 (缓冲液+底物)：Total 30ml1M Tris-Hcl pH 9.5 3ml5M NacL 0.6ml1M MgCL2 1.5mlDEPC 24.9ml（呈色緩衝液（staining buff

17、er）100mM Tris, pH=9.550mM MgCl2100mM NaCl0.05% Tween20其餘補3次過水(3d H2O)。）To avoid the diffusion of NBT and BCIP, add 5-8% (w/v) vinyl alcohol to DIG3 and heat to 80-90 degree in water bath to completely dissolve it. Cool down and add NBT and BCIP (Always keep DIG3 with vinyl alcohol in room temperature.) NBT 150lBCIP 112.6l观察：DIG3染色30min后，镜检！如果信号足够强，用Tris-HCL-EDTA (pH 8.0)终止染色；50% 乙醇室温洗涤5min100% 乙