高级生物化学

1、.PAGE ：.；PAGE 6有效成分：指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。有效成分具有含量少和稳定性差的特性。固定相：固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质如吸附剂、离子交换剂和液体物质如固定在纤维素或硅胶上的溶液，这些物质能与相关的化合物进展可逆性的吸附、溶解和交换作用。流动相：在层析过程中推进固定相上的物质向一定方向挪动的液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称洗脱剂或洗涤剂即推进有效成分或杂质向一定方向挪动的溶液。在薄层层析时流动相又称展层剂。层析：以基质为固定相柱状或薄层状，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中延续多次地进展分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合

2、物得到分别。操作容量：即在特定条件下，某种成分与基质反响到达平衡时，存在于基质上的饱和容量。普通以每克或每毫升基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。其数值越大，阐明基质对某种成分的结合力越强；否那么反之。床体积Vt：通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积VtVt是基质的外水体积V0和内水体积Vi以及本身体积(Vg)的总和，即Vt = V0 + Vi + Vg。洗脱体积Ve：洗脱体积是指某一成分从柱顶部究竟部的洗脱液中出现浓度到达最大值时的流动相体积。外水体积(V0)：外水体积是指基质颗粒之间体积的总和。内水体积Vi：内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。基质体积Vg：基质体积是指基

3、质本身所具有的体积。V0、 Vi和 Vg都是随着床体积和基质性质的变化而变化的。膨胀度：在一定溶液中，单位分量的基质充分溶胀后所占有的体积用V表示，即每克溶胀基质所具有的床体积。普通亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。分配系数是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。而迁移率是指一组分在一样时间内，在固定相挪动的间隔 与流动相挪动间隔 之比值，常用Rf 表示。K值大，就阐明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之那么结合力小，迁移率大。不同物质的分配系数和迁移率是不一样的。几种物质之间的分配系数或迁移率的差别程度，是决议它们采用层析方法能否别分开的先决条件。其差别程度越大，分别效果就越好。

4、疏水层析:疏水作用层析，它是根据有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差别性大小，进而设法将有效成分分别出来。反相层析：是有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差别性大小，分别纯化小分子质量的肽类和辅基等物质的方法，所用的载体结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质物质具有较大吸引力。凝胶过滤又叫分子筛层析，其原理在于凝胶具有网状构造，小分子物质能进入其内部，而大分子物质被排阻在外，当一混合溶液经过凝胶层析柱时，溶液中的物质就按分子质量筛分开了。亲和层析是利用生物大分子的特异的生物学性质专注地对某一种或某一类物质可经过次级键结合的特性亲和特性进展纯化的方法，与层析法结合起来就是亲和层析法。亲和层析法使

5、生物大分子的提纯变得简单、迅速和高效。双水相体系：将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度到达一定值时，体系会自然地分成互不相溶的两相，构成双水相体系。 常用双水相体系：聚乙二醇PEG/葡聚糖Dextron、PEG/磷酸盐生物大分子物质制备根本原那么：防止生物分子变性、降解1控制适当的pH； 2控制低温；3留意提取过程中的溶液环境成分的变化；4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基资料选择原那么：含量多、稳定性好 ，来源丰富、坚持新颖，工艺简单、有利用价值。 常用的测定方法：光谱法紫外光谱法、可见光谱法、荧光法、浊度法、电化学法、生物活性检测法、免疫分析法、生物传感器。测定核酸含量：当

6、A260=1时，双链DNA 50g/ml、单链DNA 37g/ml、单链RNA 40g/mlA260/ A280 : 纯DNA=1.8，纯RNA=2.0细胞的破碎：机械破碎、溶胀和自溶、化学处置、生物酶降解 抽提有效成分的影响因子：pH值、溶剂的极性和离子强度蔗糖、水解酶、温度、搅拌、氧化巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽、维生素C、多酚氧化酶、金属离子、抽提液与抽提物的比例5:1 盐析的影响因子：盐析常数Ks、盐分级范围的差别性、pH和盐浓度、蛋白质的纯度和浓度0.2-2%共沉淀景象 离子交换剂由三部分组成：基质+电荷基团+反离子根据离子交换剂中基质的组成和性质，可将其分成两大类：疏水性离子交换剂

7、 2亲水性离子交换剂交联度：交联剂在基质中所占百分数离子交换剂的影响因子：交联度大，网孔小，膨胀度小，吸水量小。 亲水性基质膨胀度大 交换剂的电荷强度强，膨胀度大带同种电荷或解离度大时pH远离pK膨胀度大 交联度越大，各要素影响越小交换容量 总交换容量：配体实践数量决议，与测定条件无关 有效交换容量：可用配体数决议，与测定条件有关 影响交换容量的要素：筛孔、离子强度、pH值离子交换剂的选择1、正确选择阴阳离子交换剂2、强弱型离子交换剂 的选择生物大分子常用弱酸碱性离子交换剂 3、不同离子型交换剂的选择 为提高交换容量，普通选择结合力较小的反离子 强酸强碱型分别选择H型和OH型 弱酸弱碱型分别选

8、择Na和Cl型4。不同基质的选择 生物大分子宜选用亲水性基质离子交换剂 缓冲液的选择：用阴离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值高一个单位 用阳离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值低一个单位3。洗脱液： 离子强度 阳离子交换剂 pH 逐渐接近pI 阴离子交换剂提高吸附剂的操作容量：在配体和基质间引入“手臂、添加配体取代的程度、配体与基质以最少的键衔接、基质多孔性的影响 、其他样品浓度、pH、离子强度、上样、洗脱速度1、抽提的含义用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分别出来的过程。用缓冲液，稀酸，稀碱或有机溶剂丙酮，乙醇等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。 理想抽提液之条件A.对有效成分

9、溶解度大，破坏作用小B.对杂质不溶解或溶解度很小C.来源广泛、价钱低廉、操作平安2、纯化方案的设计纯化方法的选择根据：有效成分与杂质的理化性质差别，如溶解度、电荷性质、分子量大小、对配体亲和力的差别等。原那么：先用粗放、快速、有利于减少样品体积和后工序处置的方法，后用准确、费时和需样品量少的方法。同一方案中忌反复运用一种分别方法 生物大分子分别纯化的普通步骤和原那么 层析法生物组织 提取液 粗产品 电泳法 结晶 超离心法 透析和超滤前处置 粗分级 细分级 前处置：1、资料选择与处置2、细胞破碎机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处置粗分级：盐析硫酸铵盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、离心细分级：根据

10、原理：分子大小、溶解度、电荷性质、吸附性质、生物亲和力纯化方案的评价对每一次搜集的溶液进展有效成分多目的测定A 含量测定蛋白总量总活力、B 比活力活力单位数/毫克蛋白C 纯化倍数每步比活力/粗抽提液比活力D 收得率每步总活力/粗抽提液总活力*100%各目的需综合思索3盐析曲线制造a/曲线制造方法 b/确定最正确盐析范围曲线制造步骤：1.取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分别溶液，调pH至稳定范围，分610次参与不同量的硫酸铵。2.第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊形状时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。3.以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，那么得到第二个分级沉淀部分。4.

11、如此延续进展，便可得到610个分级沉淀部分.5.将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜pH缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可的如图2-1所示的盐析曲线.6.在此曲线的根底上，参照表2-3的分级实验方法，根据资料来源的难易程度、有效成分纯度和得率要求等做出判别。4有机溶剂的抽提方法用苯酚、氯仿蛋白量变性剂反复处置，可使核酸-蛋白分别。离心后搜集上层含核酸水相。P34 饱和酚酚-氯仿-异戊醇氯仿-异戊醇乙醚5装柱、上样和洗脱的过程装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装法和湿装法两种。干装法系直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排

12、尽。而湿装法系统先适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液延续倾入柱中，待其自然沉降至柱高的四分之一到三分之一时翻开柱下端出口，让溶剂渐渐流出，使柱上端悬浮液徐徐下降至需求的高度。吸附剂外表要平整，应使其不断浸泡在溶剂中，严防气泡产生。后一种装柱法对各种基质都适宜。装好的层析柱应立刻与洗脱剂衔接，在约50cm高的操作压下，控制其流速，让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相，使其到达平衡，也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。经过平衡的层析柱，当平衡液留到与固定相外表一致位置时，用滴管悄然地把分别样品的溶液加到固定相外表，要尽量防止激动基质。参与样品液的

13、体积普通应小于床体积的二分之一。待样品液的液面流到固定相外表时，用滴管参与洗脱剂，并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶衔接开场洗脱。同时在柱下端与部分搜集器连通，立刻进展分级搜集。随后将搜集的每管溶液进展浓度或活性测定。根据测定结果，即可绘制出洗脱曲线。6为什么凝胶过滤时大分子先洗脱出来？凝胶过滤是利用凝胶把物质按分子大小不同进展分别的一种方法。由于被分别物质的分子大小直径和外形不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下挪动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自在进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，挪动速度慢而后流

14、出层析柱。7聚焦原理1.pH梯度溶液的构成A/离子交换层析中pH梯度的构成B/等电聚焦pH梯度的构成正极-硫酸，阴极-NaOH，载体两性电解质在两极间排布，停在各自pI=pH处，聚焦完成，电流为零。如当柱中装多缓冲交换剂阴离子交换剂PBE94固定相时，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含polybuffer96的多缓冲剂作流动相调pH到6进展洗脱。随着洗脱的进展，流动相中物质按酸性最强最弱的顺序，先后与柱中碱性最强-最弱的多缓冲交换剂结合发生中和作用，使柱内每点pH值从高到低从9-6逐渐下降，经过一段时间，从层析柱顶部究竟部就构成了pH69的梯度，此梯度是在洗脱过程中自动构成的。但是随着洗脱的进

15、展，pH梯度会逐渐下行，从底部流出的pH从9降至6，最终恒定于此值，此时层析柱的pH梯度就消逝了。见图8-28聚焦效应的原理蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进展陈列的过程叫做聚焦效应，pH梯度的构成是聚焦效应的先决条件。9疏水层析和吸附层析的区别固定相：疏水层析的固定相是亲水性或者疏水性基质加上疏水性基团配体),而吸附层析的固定相为颗粒状极性与非极性的吸附剂2、流动相:疏水层析的流动相洗脱剂由高盐到低盐，极性大到极性小的顺序流动，而吸附层析的流动相为根据盐梯度流动的极性物或者非极性的有机溶剂3、洗脱物：疏水层析洗脱顺序为极性大的物质到极性小的物质，而吸附层析洗脱顺序为极性小的物质到极性大的物质

16、。10怎样正确的选择离子交换剂？1正确选择阴阳离子交换剂 假设被分别物质带正电荷，应选择阳离子交换剂；假设带负电荷，应选择阴离子交换剂；假设被分别物质为两性离子，那么普通应根据其在稳定PH范围内所带电荷的性质来选择交换剂的种类。2强弱型离子交换剂 的选择生物大分子常用弱酸碱性离子交换剂 3不同离子型交换剂的选择 为提高交换容量，普通选择结合力较小的反离子；强酸强碱型分别选择H型和OH型；弱酸弱碱型分别选择Na和Cl型4不同基质的选择 生物大分子宜选用亲水性基质离子交换剂 11缓冲液的选择？1缓冲液的pH和离子强度直接影响分别物的交换容量2起始缓冲液的pH和离子强度应有利于样品中的有效成分与离子

17、交换剂结合，而杂质不能结合。或相反。离子强度以0.1为宜。用阴离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值高一个单位用阳离子交换剂时缓冲液pH值比有效成分的pI值低一个单位3洗脱液：离子强度应高于缓冲液 阳离子交换剂pH 逐渐接近pI 阴离子交换剂 4缓冲液选择的关键在于了解有效成分的等电点，而未知样品那么需经过实验来确定12怎样提高吸附剂的操作容量：影响操作容量的要素：配体性质、吸附剂中配体的固化量、配体的位阻效应、基质的多孔性、操作条件1在配体和基质间引入“手臂： 在配体和基质间特别是在小分子配体和基质间引入适当长度的手臂，使配体分开基质的骨架，或答应以减少基质的立体位阻效应，添加配体的活动

18、度及深化溶液的深度。但是手臂并非越长越好，过长易弯曲折叠，导致吸附容量降低。2添加配体取代的程度：想法添加基质上配体的浓度，方法有：配体量一定时，添加基质活性基团活化基质时提高pH，溴化氰用量基质活化度一定时，提高反响pH值或添加配体浓度。3配体与基质以最少的键衔接：当配体是蛋白质或多肽时，以较少的共价键衔接到载体上有利于坚持蛋白质的高级构造和生物学功能，即有利于提高吸附作用操作容量。4基质多孔性的影响 ：基质引入配体后，其多孔性可降低，其中生物胶降低厉害，比较而言，琼脂糖的多孔性稳定性较好，较适宜生物大分子的吸附。5其他：样品浓度、 pH、离子强度、上样、洗脱速度反响时间13为什么要确定测定方法要回答所采用的方案是根本合理或部分合理，还是根本不妥，就必需确立一种专注、灵敏和简便快速的测定方法，确立测定方法的目的是监控整个制备过程，评价方案的适宜性，其要求专注、准确、灵敏和简便。14双水相体系萃取法有什么优点？常用体系PEG/DEXTRON，PEG/磷酸盐，上相富含PEG,下相那么为Dextron或盐，各相各含百分之70以上的水，适宜蛋白质溶解处置容量大。2、所需设备简