酶免疫分析法

1、免疫分析法(immunoassay, IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种技术。 由于疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种 分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。1、酶免疫分析(EIA)酶免疫分析是一种非放射性标记免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体作为示 踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光，达到定量分析的目的。这种方法是对 细胞融合技术的一项重要应用。因其操作简便，不需昂贵设备，不污染环境，加 之酶标记物相当稳定，有效期长，应用范围广泛而受环境检验工作者青睐。最初 应用的EIA技术，多采用HRP标记抗体或抗原，灵敏度不高。后来逐步发展了 各种放大

2、体系，如底物循环放大体系、酶联级放大体系、生物素-亲和素放大体 系、脂质体或红细胞等作为标记物载体以包载大量标记物的放大体系，以及采用 PCR技术的PCR-EIA分析，使灵敏度有很大改进。生物素-链亲和素酶免分析(biotin avidin system BAS-EIA)1生物素(botin)广泛存在于动植物组织中，在生物体内是羧化酶的辅酶；亲 合素又名抗生物素蛋白，与生物素具有高度的亲和性，利用这一点，以生物素和 亲和素为中介，可增强抗原-抗体反应的结合提高检测方法的灵敏度。但亲和素 的非特异性结合高，后又发现另一种亲合素，称之为链亲合素(Streptavin，SA)， 克服了亲合素非特异性

3、结合高的缺点。免疫分析技术中，目前均采用SA供标记 酶或其它示踪剂。一个完整的SA分子上的4个相同亚基，都可以和一个生物素 分子结合，其Ka值达1015L/mo1，是抗体抗原反应的10100万倍。又加之一 个抗体或抗原分子结合多个生物素分子，不改变其免疫活性。脂质体免疫分析法(liposome immunoassay， LIA)1脂质体是一种生物摸拟膜，它是磷脂分子分散于水相介质中形成的密闭的双 子单层或多层的囊泡。其膜内可包容上万个标记物分子，具有很高的信号放大作 用。因此，将脂质体用于免疫分析是提高非放射免疫分析灵敏度的有效途径之一， 由此所建立起来的方法即为脂质体免疫分析法。1.3PCR

4、-EIA 分析1PCR-EIA技术是运用PCR的高度敏感性来放大抗原抗体反应的特异性，它 以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA， 由PCR产物的量来反映抗原分子的量。由于PCR的高扩增能力，只需数百个抗 原分子即可检测，甚至在理论上可检测到一至数个抗原分子。1.4酶联免疫吸附测定法（ELISA）ELISA是一种主要的免疫分析方法，又可分为直接竞争法、接竞争法、双抗 体夹心法和间接夹心法。直接竞争法是将抗体包被到聚苯乙烯微孔反应板上，加 入酶标记农药和待测农药，酶标记农药和待测农药之间与抗体的竞争而发生结合 反应。由于待测农药多，则反应后被吸附到反应板上的酶标记

5、农药少，即吸附到 酶反应板上的酶标记农药的量与待测液中农药的含量成反比。加入酶底物显色 后，进行比色，可以测定待测农药含量。间接竞争法的前一部分与抗原包被直接 竞争法相同，只是不用酶标记农药抗体（一抗），而是标记第一抗体，在竞争反 应结束后，加入酶标一抗，发生一抗与酶标一抗的结合反应，被结合的酶标一抗 的量与包被抗原结合的一抗的量的变化趋势是一致的，即被结合的酶标一抗的量 与待测农药的含量成反比。此方法的优点是一个农药抗体可以结合多个酶标一 抗，大大提高了方法的灵敏度。双抗体夹心法是将抗体包被固相载体，加入待测 抗原使其与过量的固相抗体结合，再加入过量的酶标记相同的抗体，分离固相和 游离相的化

6、合物，加入底物，据显色程度来求出样品中抗原的含量。间接夹心法 是将样品中的抗原结合于过量的固相抗体，加入过量的同种抗体（一抗），洗涤 后加入酶标一抗，最后加入底物反应，据显色程度确定待测抗原的含量。2、免疫分析技术在环境领域中的应用1960，Yalow和Berson年第一次应用免疫分析技术检测血清中的胰岛素。 随后，免疫分析技术迅速发展起来，但主要集中在生物化学、临床医学等领域。 直到20世纪80年代免疫分析技术对环境化学物质检测的应用才受到了重视。1971年，Ercegovich首先提出了将免疫化学方法应用到环境领域。他建议用 免疫学的筛选方法快速检测农药残留。1975年，杀虫剂、艾氏剂和狄

7、氏剂的放 射免疫分析作为免疫分析应用于环境污染物检测领域第一次报道出来。在初始阶 段，研究者将注意力集中在了农药的免疫学分析中，他们做了大量的工作，所用 的技术主要是放射免疫法（RIA）。1972年，Vanweemen和Engavall等人建立了 酶免疫测定方法（enzyme immunoassay， EIA）。1975 年，Koh ler 和 Mil-stein 利 用杂交瘤技术制备出单克隆抗体（McAb）。但是由于各方面条件的限制，这两项 技术在环境检测领域中的研究应用未引起足够的重视。进入20世纪80年代， EIA首先应用到农药的检测中，1982年Huner和Wie分别报道了对硫磷和除虫

8、 脲的EIA法检测。此后，EIA和McAb被广泛应用于各个领域的环境污染物的 免疫分析。1989年，美国环境保护局、农业部食品安全检验司和美国分析化学家组织 共同制定了农药残留免疫学检验商品试剂盒评定和认可的建议准则。免疫分析得 到了大多数科学团体和执法机构的认可。目前，至少有十几种商业免疫试剂盒被 EPA认可。2.1免疫分析技术在农药残留分析中的应用免疫测定技术在环境污染物上的应用首先是在农药方面的检测。最初，大多 数学者研究农药免疫分析技术的目的只是用于临床检测农药中毒病人血清、尿样 和组织中的农药残留水平。后来逐渐被环境研究者重视开始用于环境领域。在环 境方面的应用最早的是美国，他们把这

9、一方法应用于地下水和河水中除草剂的检 测分析中。现在已经开发出几十种农药的免疫测定技术。EIA技术可以用于检测水、土壤、食品中的各种农药残留，方法简便：决速 前处理程序简化（不需净化），反应既可在试管中进行，也可在微孔板上进行； 若在96孔板上，每次可分析几十个样品，A可同时作出标准曲线。目前应用最 多的是酶联免疫吸附（ELISA）测定法。Seliske等采用竞争ELISA法用兔抗白草枯抗体包被磁株固相检测百草枯， 从各种水果和蔬菜中提取百草枯只用30 min，检出限为10 ng L-1，平均回收率 达99%，而用分光光度计法样品提取则击5 h，两种检测方法相关系数达0.994。 Schlae

10、ppi等运用直接竞争ELISA法和间接竞争ELISA法分别检测土壤中的异内 甲草胺，产生的抗异内甲草胺单克隆抗体有极强特异性，与其代谢产物无交义反 应，直接和间接竞争ELISA法对土壤中异内甲草胺的回收率分别为98%和89%。 Brandon等在1994年制备了一种可以与苯并咪叶类药剂（内硫多菌灵、芬苯达 叶、奥芬达叶及它们的代谢物）结合的单克隆抗体，该抗体也可与甲基苯并咪 Ash氨基甲酸醋（苯菌灵的一种代谢物）结合。新的半抗原5 （6）-（烃基戊基 硫代）-2-苯并咪叶氨基甲酸醋可在大鼠体内得到，这种改进了的ELISA法可以 检测苯并咪叶及多种农药，检出限为1-8 . gkg-1。我国的研究

11、者也自行开发了许多EIA检测方法：成功地合成了对硫磷人 工抗原，并在免疫的兔了体内获得高效抗血清。在此基础上，应用了 ELISA法 对梨、苹果中的对硫磷残留量进行检测，并以GC法验证，充分说明其具有良好 的重现性。通过化学方法，将杀虫眯偶联到载体蛋白上制成抗原，然后免疫 BA LB/ C小鼠。经细胞融合、筛选、克隆等步骤，获得了抗杀虫眯的特异性抗 体，并以该抗体建立了大米中杀虫眯残留量的单克隆抗体ELISA检测方法。 应用B淋巴细胞杂交瘤技术，研制出特异性强的T-2毒素的单克隆抗体，并建立 了小麦T-2毒素的ELISA检测方法。农业中应用举例：酶联免疫吸附分析法测定水样中的阿特拉津赵银丽等利用

12、免疫学原理合成恩诺沙星的完全抗原(BSA-ENR)免疫小鼠, 然后应用细胞融合技术将小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合成杂交瘤，通过酶联免 疫试验筛选分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并以抗恩诺沙星的单克隆 抗体(ENR mAb)为基础研制检测恩诺沙星残留的竞争ELISA试剂盒(competitive ELISA ENR-Kit)，并测定其性能。结果表明:筛选出的2株杂交瘤细胞，单抗亚类均 为IgG1型，其中4G1-B3株的ENR mAb间接ELISA效价为1:1.024X 106，亲 和常数(Ka)为9X1010L/mol；竞争ELISA试剂盒的线性检测范围为0.05101.6 M g/L、灵

13、敏度0.05p g/L、半数抑制浓度(IC50)1.川g/L,与其他化合物的交叉反 应率(CR%0小于0.01 %，鸡肉样、鸡肝样、鱼肉样和牛奶样的平均添加回收率 分别为81.5%、87.6%、84.3%和95%，不同基质添加恩诺沙星标准品做竞争ELISA 对ENR-Kit检测结果影响小，试剂盒保存期6个月以上。检测所有样品的平均 变异系数均小于10%，并且不同基质中添加标准品所建立的标准曲线非常相似, 对检测结果影响小。所以该试验建立的竞争ELISA方法可以对恩诺沙星在多种 动物性产品中的残留进行检测,符合国家的检测标准。结果说明该竞争ELISA试 剂盒具有快速、敏感、特异、简便等特点，适用

14、于ENR残留的快速检测。2.2免疫分析技术在工业污染物上的应用工业污染物的免疫测定研究始于20世纪80年代，进入20世纪90年代后， 研究者在前人的基础上进行了进一步的研究。2002年，西班牙人Patricia Noguera， Rosa Puchades等改进了五氯酚(PCP)的酶免疫检测技术，他们将PCP的检测 限提高到 0.1ng mg-1。1997 年，Harrion R O， Carlson R E， Carlson R E 制备 了 2, 3, 7, 8-TCDD的单克隆抗体，用竞争性抑制法建立了 2种测定方法，一 种是酶联管，检测灵敏度100pg 管-1，另一种是酶联板，检测灵敏

15、度25 pg 孔 -1。1999 年，Mei Liu，QingX Li，Garry A Rechnitz建立了 PAHs 的流动注射免疫 测定技术。Y su gawarea等用ELISA法测定2,3,7,8-TCDD的IC50值是12 pg孔 管-1，可测定的浓度范围是2-240 pg 孔槽-1,即40-480 pg mg-1。B E Watkins 等制备的单克隆抗体测定TCDD的IC50是200 pg 孔槽-1。Y W Chiu等开发了 共面 PCB、3, 4, 3，4-PCB ； 3, 4, 3，4，5-PCB 的 ELISA 测定方法。2.3免疫分析技术在重金属上的应用理论上只要能够产

16、生特异性的抗体，就可以采用免疫技术。随着免疫技术在 环境有机污染物方面的应用，重金属研究者一也把目光转移到免疫技术上。1991 年，Dwane E Wylie Larry D Carlson等制备出了汞的单克隆抗体，建立了 ELISA 检测方法，检测的范围在0.5-10p gL-1该方法与原子吸收方法的相关系数大于 0.99。1998 年，Mehraban Khosraviani Diane ABlake 等制备了 Cd-EDTA 特异性单 隆抗体，能够检测7-500p gL-1浓度的Cd (II)。2.4问题与展望环境残留物质免疫分析方法尚处在研究和开发阶段，目前在我国还没有得到 普遍的认可

17、。由于环境污染残留物的种类多，既有化学工业污染物又有农药和重 金属等，因此免疫检测分析系统的建立也不相同。目前主要存在以下问题：环境污染物都为小分子物质，不具有免疫原性，需要与大分子物质(如 BSA, OVA, KLH等)结合后才能被动物的免疫系统识别，产生抗体，这就需 要环境污染物半抗原制备要经过仔细的设计，既保留环境污染物分子的基木特 征，又要能够很好地与大分子结合。因此，对半抗原的合成提出了很高的要求。抗体的产生机理还不是很明确，这对抗体的特异性有很大的影响，而 环境污染物的分子结构复杂，许多工业污染物结构相似，许多农药是通过修饰同 一母体结构上的特定集团衍生出来的，这样在免疫分析过程中

18、这些结构类似的化 合物往往会产生很强的交叉反应，出现假阳性结果，检测人员只能确定是某类化 合物的残留，因此人们大多把免疫分析作为一项初检的技术来应用。(2) 一般1种特异性的抗体只能检测1种或者几种结构相似的少数化合物， 如果是多残留检测，这就给分析增加了成本。(4)免疫分析依赖的是抗原和抗体的反应，该反应受外界的影响很大(pH 值、离子强度、有机溶剂的干扰、反应的时一间、反应的温度等)。而环境样品 又非常复杂，涉及土壤、水和植物等。因此，免疫检测技术的建立要详尽考虑十 扰因素。免疫技术在40年的发展中不断出现新方法和新手段，有力地推动了环境污 染物免疫分析技术的快速发展，相继出现了脂质体免疫测定法、流动注射免疫分 析、克隆酶给子体免疫测定法、控温相分离免疫测定法等新技术，此外免疫技术 与其他技术联用，利用各种技术的特点，弥补相互之间的不足，可以更好地应用 十环境中的各种污染物的分析，如免疫分析与流动注射系统相结合形成流动注射 免疫分析，免疫分析与传感器结合形成免疫传感器，免疫技术与气相、液相色谱 联用等。未来免疫分析技术的发展将主要集中在多残留组分免疫测定法、