DB34-T 4198-2022 梨黑斑病菌的LAMP检测方法

1、ICS 01.040.6534CCS B 1634安徽省地方标准DB34/T41982022梨黑斑病菌的 LAMP 检测方法Detection of Alternaria species involved in pear black spot using LAMP20222022062920220729安徽省市场监督管理局发 布DB34/T 41982022前言本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提出。本

2、文件由安徽省农业农村厅归口。徽省农业科学院园艺研究所、怀远县农业技术推广中心。本文件主要起草人：杨雪、谷春艳、潘锐、翟承勋、徐会永、臧昊昱、戚仁德、高正辉、齐永杰、王同岁。IIDB34/T 4198DB34/T 41982022DB34/T 4198DB34/T 41982022梨黑斑病菌的 LAMP 检测方法范围本文件规定了梨黑斑病菌的 LAMP 检测方法。本文件适用于梨黑斑病菌检测的组织和人员。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法术语和定义梨黑斑病 pear black spot由链格孢类（Alternaria梨黑斑病 pear b

3、lack spot由链格孢类（Alternariaspp.）真菌引起的一种重要病害，已报道病原菌主要包括Alternaria gaisenK.Nagan、A.alternata(FrKeissler、A.tenuissima(FrWiltsh、Ainfectoria、A. yaliinficiens R. G. Roberts 和 A. ventricosa R. G. Roberts。4 方法原理根据梨黑斑病病原菌的 cytb 序列设计的特异性引物进行 LAMP（Loop - mediated isothermalamplification, 环介导等温扩增技术）检测作为判断梨黑斑病菌的依据

4、。5 仪器设备高速离心机：转速15000 r/min涡旋振荡器恒温金属浴光照培养箱：2030 超低温冰箱：-80电泳仪凝胶成像仪可调移液器：1-10 L，10 L-100 L，100 L-1000 L6 试剂和培养基1 培养基WA 培养基（琼脂粉 20 g，加水 1000 mL），PDA 培养基（去皮马铃薯 200 g，蔗糖（或葡萄糖）20 g，琼脂粉 20 g，加水补足至 1000 mL）。 DNA2CTAB（100mmol/LTris-HClpHmmol/Lmol/Lw/v) mmol/L（用时加入 /氯仿/异戊醇 mmol/LTris-HCL(pH8.0)，1mmol/LEDTA）。 L

5、AMPBst DNA 聚合酶，甜菜碱（Betaine），显色剂 SYBR Green I，TAE 电泳缓冲液 (Tris 4.84 g， Na2EDTA2H20 0.75 g，冰乙酸 1.142 mL，加水至 1000 mL，pH 8.5)，琼脂糖。除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682 中三级水的标准。7 检测方法 病原菌分离与纯化将梨病果用 75乙醇表面消毒 30 s 后，于病健交界处取少量组织置于 WA 培养基中 28培养。待长出菌丝后，切取一小块放在 PDA 培养基中于培养 7 d 左右，收集菌丝于 4备用。 DNACTAB900L2CTAB90L

6、10SDS60 1 h，期间每隔 10 min12000rpm10min；取上清，加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）12000rpm5min；将上清转移至新的EP12000 rpm5 minEP1，-20条件沉淀 15 min；常温条件下 12000 rpm5 min，倾702，37TE（pH 8.0） 溶解沉淀（20g/mlRNase），3730min，-20保存备用。DNADNA 所用引物所用引物设计参见附录A.1。F3：5- GGCTCCTTTGAATGGTAAC -3； B3：5- TGTCTTCAACCAAGCATCA -3；FIP：5- CGCTGCAAGTAATCTAT

7、AAATCGGATTCAATAGGCAAATGGGGA -3； BIP：5- AATGGATCAAGAACGTTCAACGAATTGGTTGTGGGGTACTC-3 。 检测体系LAMP扩增反应体系总体积为20L，由下列浓度体积的组分组成名称浓度加入量F310 M0.6LB310 M0.6L2FIP40 M0.6 LBIP40 M0.6 LMgCl225 mM3.2 LBetaine4 M1.6 LdNTPs10 mM2.0 LBst DNA聚合酶8 U/L0.8 L10ThermoPol2.5 LDNA 模板40 ng /L1 L用无菌双蒸水补充扩增体系体积至 20 L，65保温 60 min。8 结果判定LAMP 扩增反应结束按照以下任意一种方式观察结果：SYBRGreenILAMP（参见附录A.2）。3明含有梨黑斑病菌；如果电泳图谱无扩增条带，表明不含有梨黑斑病菌（A.3）。33附 录 A（资料性） 引物设计示意图见图A.1。图A.1LAMP见图A.2。见图A.2。标引序号说明：M