王广发睡眠面上最终版2011

1、 国家自然科学基金申请书 2011版PAGE 7第 PAGE 4 页 版本1.002.665申请代码受理部门 收件日期受理编号国家自然科学基金申 请 书(2011版) 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是Word2000,word XP, word 2003或以上版本用户，请把Word宏的安全性设为:中 方法: Word菜单-工具-宏-安全性-安全级,设置为中 (如果您是Word97用户，继续执行以下步骤) (如果您是Office2007用户，点击word左上角安全警告处选项中的启用此内容) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击启用宏按钮，即可开始填写本

2、文档或打印了资助类别： 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 申 请 人： 电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码： 单位电话： 电子邮箱： 申报日期： 201 FORMTEXT 1年 FORMTEXT 2月 FORMTEXT 23日国家自然科学基金委员会基本信息yoKWT/OQ申 请 人 信 息姓名性别男出生年月1963年10月民族汉族学位博士职称教授每年工作时间（月）8 电话83575059 电子邮箱wangguangfa 传真66551208 国别或地区中国个人通讯地址北京市西城区西什库大街8号 工作单位北京大学 /第一医院主要研究领域呼吸病学 依托单位信息名称联系人刘超 电子邮箱liu

3、chao105 电话62751449 网站地址 合作研究单位信息单 位 名 称项 目 基 本 信 息项目名称资助类别面上项目 亚类说明 附注说明 申请代码H0113:睡眠呼吸障碍H25:老年医学基地类别 研究期限2012年1月 2015年12月研究属性应用基础研究 摘 要(限400字)： FORMTEXT 临床及流行病学研究强烈提示睡眠呼吸暂停（SA）与老化机制相关。SIRT1为重要的老化因子，且调节与SA关系密切的5-HT受体系统。推测SIRT1-CREB-BNDF-5-HTRs调节通路是SA的重要调控机制。通过观察增龄及SIRT1激动剂和拮抗剂干预对大鼠在体脑干神经元凋亡和SIRT1、CR

4、EB、BDNF、NOS、5-HTR1B/2A/2C表达影响及与SA关系，用微透析观察上述因子对SA和舌下神经兴奋性影响及交互效应，利用膜片钳观察对神经元电活动的影响及交互作用，研究SIRT1激动剂/抑制剂及表达变化对神经元凋亡和5-HTR1B/2A/2C表达及BNDF、5-HTR1B/2A/2C等激动剂、抑制剂的交互影响，从而阐明SIRT1-CREB-BNDF-5-HTRs在睡眠呼吸暂停发生上的作用，从老化调控角度揭示SA本质，为认识SA发病机制，寻找新药物靶点，设计新治疗药物提供依据。关 键 词(用分号分开，最多5个) FORMTEXT SIRT1; 5-HT受体;老化（aging）; 呼吸

5、调控（respiratory control）；睡眠呼吸暂停（sleep apnea） 项目组主要参与者（注: 项目组主要参与者不包括项目申请人）编号姓 名出生年月性别职 称学 位单位名称电话电子邮箱项目分工每年工作时间（月）11971-3-9 女副主任医师博士北京大学 83575707 细胞培养；分字生物学 6 21965-11-16 女副主任医师博士北京大学 83575677 动物实验 6 31983-2-3 男主治医师博士北京大学 83575707 softsnake 分子生物学 8 41987-1-12 女博士生学士北京大学 83575707 动物实验 分生实验 10 51985-12

6、-5 女博士生硕士北京大学 83575707 zhaocan- 细胞培养，膜片钳 6 61968-1-11 男技师其他北京大学 83572641 辅助实验 6 7 8 9总人数高级中级初级博士后博士生硕士生 FORMTEXT =ffdMmb_seniorno+ffdMmb_middle_no+ffdMmb_juniorno+ffdMmb_postdrno+ffdMmb_drcanno +ffdMmb_mscanno 77 FORMTEXT 3 FORMTEXT 1 FORMTEXT 1 FORMTEXT 0 FORMTEXT 2 FORMTEXT 0说明: 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕

7、士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。经费申请表 （金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费 FORMTEXT =sum(tbl_budget b3:b3) + sum(tbl_budget b9:b9)+ sum(tbl_budget b12:b12) + sum(tbl_budget b15:b16) 6060.0000 FORMTEXT 1.科研业务费 FORMTEXT =sum(tbl_budget b4:b8) 7.57.5000 FORMTEXT （1）测试/计算/分析费 FORMTEXT 2.0000 FORMTEXT 图像分析

8、、统计分析等（2）能源/动力费 FORMTEXT 0.0000 FORMTEXT 1 FORMTEXT （3）会议费/差旅费 FORMTEXT 2.5000 FORMTEXT 会议及学术交流（4）出版物/文献/信息传播费 FORMTEXT 2.0000 FORMTEXT 发表文章、复印文献等（5）其他 FORMTEXT 1.0000 FORMTEXT 标本运送等2.实验材料费 FORMTEXT =sum(tbl_budget b10:b11) 4848.0000 FORMTEXT （1）原材料/试剂/药品购置费 FORMTEXT 48.0000 FORMTEXT 膜片钳试剂、分子生物学试剂、实

9、验动物、电极、耗材等（2）其他 FORMTEXT 0.0000 FORMTEXT 3.仪器设备费 FORMTEXT =sum(tbl_budget b13:b14) 4.54.5000 FORMTEXT （1）购置 FORMTEXT 4.5000 FORMTEXT 多导生理仪及监测用电脑、移液抢4把、大鼠脑立体定位仪一台，微电极拉制仪，振动切机（2）试制 FORMTEXT 0.0000 FORMTEXT 4.实验室改装费 FORMTEXT 0.0000 FORMTEXT 5.协作费 FORMTEXT 0.0000 FORMTEXT 二.国际合作与交流费 FORMTEXT =sum(tbl_bu

10、dget b18:b19) 44.0000 FORMTEXT 1.项目组成员出国合作交流 FORMTEXT 4.0000 FORMTEXT 项目组成员参加国际交流2.境外专家来华合作交流 FORMTEXT 0.0000 FORMTEXT 三.劳务费 FORMTEXT 12.0000 FORMTEXT 用于直接参加项目研究的研究生劳务费四.管理费 FORMTEXT 4.0000 FORMTEXT 依托单位为组织和支持项目研究而支出的费用合 计 FORMTEXT =sum(tbl_budget b2:b2)+sum(tbl_budget b17:b17)+sum(tbl_budget b20:b2

11、1) 8080.0000 FORMTEXT 与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费 FORMTEXT 0.0000其他经费资助（含部门匹配） FORMTEXT 0.0000其他经费来源合计 FORMTEXT =sum(tbl_budget c23:c24) 0.00.0000第 PAGE 28 页 申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、 请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、 在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、 请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；4、 本要求将作为申请书正文撰写

12、是否规范的评判依据，请遵照要求填写。报告正文面上项目申请书撰写提纲（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）： 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）老化（aging）是人体的一种自然现象，但在这一过程中，加速的老化会引发相关的疾病。目前已证明，多种疾病与老化相关，例如阿尔茨海默病（）、动脉粥样硬化、心力衰竭、糖尿病以及COPD等。其中中枢神经系统老化引起的疾病最为显著，也最为普遍。研究表明增龄性的神经元退行性或可塑性的变化，可影响突触传导、神

13、经递质释放、信号转导等，是众多中枢神经系统疾病的重要机制，但不同脑区及神经核团的老化对中枢神经系统的功能影响不同。例如：衰老相关的黑质纹状体系统的损害可导致帕金森病。大脑皮层的退行性改变是阿尔茨海默病的主要的病理学特征之一。那么对于脑干呼吸中枢，其呼吸节律产生的神经核团、化学敏感的神经核团、呼吸运动神经核团等呼吸相关的神经元若发生老化，则有可能影响到呼吸中枢的正常功能，引起呼吸中枢调控不稳，引发呼吸暂停、周期性呼吸等。睡眠呼吸暂停低通气综合症（OSAHS）严重危害人类健康23，但其发生机制目前仍不清楚。目前已充分认识到，OSAHS的发生并非单纯与解剖结构异常相关，更为重要的是与呼吸中枢调控密切

14、相关 ADDIN NE.Ref.BAC575AE-4BAC-4875-BB5E-B2B873AB66C71。虽然我们前期研究 ADDIN NE.Ref.348C9C69-07D7-432F-929C-FA774410266A2-4及其他学者的研究 ADDIN NE.Ref.0E4A21D7-9143-41B6-8EE6-20939BA6EC825显示呼吸中枢某些离子通道及5-HT及其受体系统参与睡眠呼吸暂停的发生密切相关，但这些下游通道或受体系统发生改变的上游调控机制并不清楚。流行病学及临床研究强烈提示睡眠呼吸暂停的发生可能与中枢老化机制相关。首先，OSAHS发病随年龄增加而增加，国外报告65

15、岁以上老年人SAS患病率高达20%-40%，显著高于非老年人 ADDIN NE.Ref.1D3BCA3A-D324-42A2-A941-DEDB95BD78106,7。其次，中枢型呼吸暂停和周期性呼吸在老年人睡眠呼吸暂停更为普遍 ADDIN NE.Ref.409906E1-98CD-4D6F-8107-A03D880EBCE86-8。老年OSAHS患者中枢型睡眠呼吸暂停（CSA）大约占全部呼吸紊乱事件的1/3 ADDIN NE.Ref.BD44F9C6-66E2-4EDC-8F32-F7B31B35C31B6,9。在合并心衰的老年患者中，年龄增加是发生中枢呼吸暂停和陈-斯呼吸的独立危险因素24

16、。动物实验研究也发现，随着年龄的增长，大鼠膈稳定呼吸和保持上气道的开放的代偿机制减弱 ADDIN NE.Ref.D98426AC-91FF-4F4B-B617-7342F7084F5910,11。而在人类这会增加患OSAHS的风险。这些现象强烈提示我们，呼吸调控中枢的老化机制可能是导致老年患者在睡眠状态下呼吸的不稳定，可能是OSAHS的重要原因之一。推测即使非老年的OSAHS可能也存在呼吸中枢加速老化的可能。然而现实却令人失望，到目前为止，尚缺乏对呼吸中枢神经元的老化机制研究。目前不清楚哪些因子涉及呼吸中枢老化调节，更无从谈起何种老化相关因子涉及OSAHS的发病。解决这一问题成为本领域迫切需要

17、探索和研究的关键问题。已知去乙酰化酶SIRT1（Human sirtuin 1）基因是一个重要的衰老相关基因。它是沉默信息调节因子2 (Silent information regulator2, SIR2)在哺乳动物的同源基因。其表达的SIRT1蛋白是NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶，通过去乙酰化作用调节基因转录 ADDIN NE.Ref.684F1215-C637-4918-AC97-2D70765900F612。研究表明其表达的减少可引起细胞抗氧化应激能力的降低，自我修复能力的下降并影响细胞凋亡 ADDIN NE.Ref.5F28EC48-846B-4992-BB60-0F772DD52FB

18、B13-15。令人鼓舞的是，2010年最新研究显示，SIRT1还可以直接调控神经细胞的生理功能 ADDIN NE.Ref.E2D3F2DF-D800-45B2-8D32-7ED6204D3B8416。SIRT1表达降低，导致其下游的蛋白环腺苷酸反应元件结合蛋白（CREB）、脑源性神经营养因子(BDNF)表达的降低 ADDIN NE.Ref.A3D8D153-C4A6-417C-B519-6C5975331E5416。而这是很多重要的神经生理功能如学习、记忆，乃至中枢呼吸调节的基础。临床研究已经揭示去乙酰化酶（SIRT1）基因调控与神经变性性疾病(阿尔兹海默病等)密切相关。据此，我们有理由相信S

19、IRT1可能也参与呼吸中枢的老化过程，但目前缺乏这方面的研究。有研究显示，SIRT1可能是调控呼吸中枢的重要神经递质系统5-HT及其受体系统（5-HT system）上游调节因子。首先，如上所述，SIRT1 表达降低可以下调 BDNF的表达 ADDIN NE.Ref.4FE375A9-4E4B-4B9B-95E9-9768171239D116。而BDNF表达下降，会影响5-HT神经元的生长和生存 ADDIN NE.Ref.8FACD75A-8021-4439-AB28-6829786EB1FE17, 并且下调5-HT2A受体的表达 ADDIN NE.Ref.F70ABEBE-9D42-4357

20、-8453-BB135D5A358E18。进而使5-HT/ 5-HT 受体系统功能下降。其次，SIRT1表达减少后，通过复杂的信号转导途径使NO生成减少。而NO生成减少会抑制、干扰5-HT 系统的表达和功能 ADDIN NE.Ref.016B313F-B797-4DB9-8B25-C9D353827A7E19。此外研究还表明，5-HT 系统也受老化过程的影响，其表达和功能也具有年龄依赖性的特点 ADDIN NE.Ref.DE706DFC-EF70-4451-9B88-1212F53FA20020。5-HT能的神经末梢（serotonergic terminals）、5-HT及其代谢产物的浓度、

21、5-HT受体密度等均受年龄影响 ADDIN NE.Ref.4972A074-9914-4CE5-AD7B-B35872E7E5755。因此，我们推断，增龄性的SIRT1基因沉默或表达下调，可能会影响5-HT及5-HT受体的表达和功能，进而影响呼吸中枢的调控。我们前期的研究已经证明，5-HT/5-HT受体在呼吸调控和睡眠呼吸暂停中发挥了重要作用。大鼠脑干5-HT2A、 5-HT2C受体表达量与睡眠呼吸暂停指数存在相关性；而间歇低氧伴高CO2又可诱导SD大鼠脑干5-HT2A受体、5-HT2C受体表达上调。第四脑室微注射5-HT及5-HT2受体激动剂DOI可明显增强颏舌肌肌电强度，而5-HT2受体拮

22、抗剂Ketanserin则降低颏舌肌肌电 ADDIN NE.Ref.CD071E8D-65C5-401A-B204-B1996C113C982,21。全身给予5-HT再摄取抑制剂帕罗西汀以及中枢给予5-HT均可降低了大鼠的睡眠呼吸紊乱指数 ADDIN NE.Ref.BD2039DF-85EC-4EF3-8B98-7884CA8621C822。此外，通过膜片钳实验还发现，5-HT 及5-HT受体可以调控中枢化学感受器分子TASK-1的电流 ADDIN NE.Ref.F0D4779D-E0C9-423A-86F9-BE13D15BB8083，进而影响到呼吸中枢的兴奋性。根据上述的研究，我们提出睡眠

23、呼吸暂停发生如下的假说（见图1）：中枢SIRT1基因沉默导致SIRT1蛋白表达下调，造成细胞损伤凋亡增加，同时通过CREB、BDNF、NOS等的信号转导途径引起5-HT/5-HT受体系统表达或功能异常，最终导致呼吸中枢调控不稳，引发呼吸暂停。图1SIRT1呼吸中枢神经元氧化应激损伤、凋亡BDNFNO5-HT/5-HTR系统呼吸中枢调节呼吸暂停CREB为证明上述假说本项目计划进行下列研究：1、研究SIRT1、CREB、BDNF、NOS、5-HT1B/2A/2C表达水平与睡眠呼吸暂停的相关性；2.观察SIRT1的激动剂和抑制剂对大鼠睡眠呼吸暂停及脑干中SIRT1、CREB、BDNF、NOS、5-H

24、T受体1B/2A/2C表达水平的影响；利用微透析技术，观察第四脑室灌入SIRT1、BNDF、NOS、5-HT1B/2A/2C受体等的特异性激动剂和抑制剂对大鼠睡眠呼吸暂停的影响及交互作用；3.利用微透析技术，观察第四脑室内分别灌入SIRT1、BNDF、NOS、5-HT1B/2A/2C受体等的特异性激动剂和抑制剂，观察大鼠颏舌肌电活动的变化及交互效应。通过膜片钳技术观察SIRT1、BNDF、NOS、5-HT1B/2A/2C受体等的特异性激动剂和抑制剂对舌下神经核神经元电活动的影响及交互影响；4.观察SIRT1、BNDF、NOS等的激动剂和抑制剂对培养脑干神经元5-HT1B/2A/2C受体的表达水

25、平及交互影响；5. 观察SIRT1基因及其干扰RNA转入及BNDF、NOS等的激动剂和抑制剂观察神经元5-HT1B/2A/2C受体的表达的影响及交互作用。本研究从老化分子机制这一崭新视角入手，有可能获得开启OSAHS中枢机制奥秘的一把钥匙，揭示睡眠呼吸暂停发生的呼吸中枢上游分子机制，这将有助于深化对OSAHS发生机制的认识，对探索更为有效的干预靶位，研发新的治疗药物具有重要意义。 ADDIN NE.Bib参考文献 1White DP. Pathogenesis of obstructive and central sleep apnea. Am J Respir Crit Care Med 2

26、005; 172:1363-1370 2Zhong YJ, Zhang C, Wang GF. Effects of 5-hydroxytryptamine and 5-hydroxytryptamine 2A/2C agonist on the genioglossus activity and sleep apnea in rats. Chin Med J (Engl) 2010; 123:2094-2098 3Xu XF, Tsai HJ, Li L, et al. Modulation of leak K(+) channel in hypoglossal motoneurons of

27、 rats by serotonin and/or variation of pH value. Sheng Li Xue Bao 2009; 61:305-316 4Wang J, Zhang C, Li N, et al. Expression of TASK-1 in brainstem and the occurrence of central sleep apnea in rats. Respir Physiol Neurobiol 2008; 161:23-28 5Seebart BR, Stoffel RT, Behan M. Age-related changes in the

28、 serotonin 2A receptor in the hypoglossal nucleus of male and female rats. Respir Physiol Neurobiol 2007; 158:14-21 6Bixler EO, Vgontzas AN, Ten HT, K Tyson, A Kales. Effects of age on sleep apnea in men: I. Prevalence and severity. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157:144-148 7林小冰, 肖嘉新. 老年人睡眠呼吸暂停综合征

29、临床特点与治疗（附204例分析）. 福建医药杂志 2002; 24:71-72 8Wellman A, Malhotra A, Jordan AS, Schory K,Gautam S,White DP. Chemical control stability in the elderly. J Physiol 2007; 581:291-298 9Browne HA, Adams L, Simonds AK, Morrell MJ. Ageing does not influence the sleep-related decrease in the hypercapnic ventilato

30、ry response. Eur Respir J 2003; 21:523-52910Zabka AG, Behan M, Mitchell GS. Long term facilitation of respiratory motor output decreases with age in male rats. J Physiol 2001; 531:509-51411Mahamed S, Mitchell GS. Is there a link between intermittent hypoxia-induced respiratory plasticity and obstruc

31、tive sleep apnoea? Exp Physiol 2007; 92:27-3712Michan S, Sinclair D. Sirtuins in mammals: insights into their biological function. Biochem J 2007; 404:1-1313Ghosh HS, Spencer JV, Ng B, McBurney MW, Robbins PD. Sirt1 interacts with transducin-like enhancer of split-1 to inhibit nuclear factor kappaB-

32、mediated transcription. Biochem J 2007; 408:105-11114Cohen HY, Miller C, Bitterman KJ, Wall NR, Hekking B, Kessler B, Howitz KT, Gorospe M, de Cabo R, Sinclair DA. Calorie restriction promotes mammalian cell survival by inducing the SIRT1 deacetylase. Science 2004; 305:390-39215Maria Carla Motta1, 5

33、, Nullin Divecha2, 5, Madeleine Lemieux4, Christopher Kamel4, Delin Chen3, Wei Gu3, Yvette Bultsma2, Michael McBurney4 and Leonard Guarente. Mammalian SIRT1 represses forkhead transcription factors. Cell 2004; 116:551-56316Jun Gao, Wen-Yuan Wang,Ying-Wei Mao, Johannes Grff, Ji-Song Guan, Ling Pan, G

34、loria Mak, Dohoon Kim, Susan C. Su & Li-Huei Tsai. A novel pathway regulates memory and plasticity via SIRT1 and miR-134. Nature 2010; 466:1105-110917Mattson MP, Maudsley S, Martin B. BDNF and 5-HT: a dynamic duo in age-related neuronal plasticity and neurodegenerative disorders. Trends Neurosci 200

35、4; 27:589-59418Trajkovska V, Santini MA, Marcussen AB. BDNF downregulates 5-HT(2A) receptor protein levels in hippocampal cultures. Neurochem Int 2009; 55:697-70219Silvana Chiavegatto , Valina L. Dawson , Laura A. Mamounas, Vassilis E. Koliatsos, Ted M. Dawson, and Randy J. Nelson. Brain serotonin d

36、ysfunction accounts for aggression in male mice lacking neuronal nitric oxide synthase. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98:1277-128120E Sibille, J Su, S Leman, A M Le Guisquet, Y Ibarguen-Vargas, J Joeyen-Waldorf, C Glorioso, G C Tseng, M Pezzone, R Hen and C Belzung. Lack of serotonin1B receptor exp

37、ression leads to age-related motor dysfunction, early onset of brain molecular aging and reduced longevity. Mol Psychiatry 2007; 12:1042-1056, 97521钟益珏, 张成, 王广发. 5-羟色胺2受体激动剂及拮抗剂对大鼠睡眠呼吸暂停的影响. 中华结核和呼吸杂志 2010; 33:350-35322王瑶, 王广发, 张成. 帕罗西汀对SpragueDawley大鼠睡眠呼吸暂停的影响. 中国呼吸与危重监护杂志 2009; 8:384-38723张王君辉， 黄席

38、珍. 睡眠呼吸暂停/低通气综合征的危害性及健康指导. 中国全科医学 HYPERLINK 1/cbmbin/search.dll?searchj?code=&jnl=中国全科医学&py=2002&ip=3 2002.03.25; 5(3): 185-18724 HYPERLINK /pubmed?term=%22Sin%20DD%22%5BAuthor%5D Sin DD, HYPERLINK /pubmed?term=%22Fitzgerald%20F%22%5BAuthor%5D Fitzgerald F, HYPERLINK /pubmed?term=%22Parker%20JD%22%5

39、BAuthor%5D Parker JD, HYPERLINK /pubmed?term=%22Newton%20G%22%5BAuthor%5D Newton G, HYPERLINK /pubmed?term=%22Floras%20JS%22%5BAuthor%5D Floras JS, HYPERLINK /pubmed?term=%22Bradley%20TD%22%5BAuthor%5D Bradley TD. Risk factors for central and obstructive sleep apnea in 450 men and women with congest

40、ive heart failure. HYPERLINK javascript:AL_get(this,%20jour,%20Am%20J%20Respir%20Crit%20Care%20Med.); o American journal of respiratory and critical care medicine. Am J Respir Crit Care Med. 1999 Oct;160(4):1101-6项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）研究内容：1. SIRT1在大鼠呼吸中枢表达及与睡眠呼吸暂停关系的研究：对比老年和非老年Sprag

41、ueDawley（SD）大鼠睡眠呼吸暂停发生的程度，并检测脑干中神经元凋亡及SIRT1、CREB、BDNF、NOS、5-HT1B/2A/2C表达水平，比较两组表达差异并分析这些因子的表达与睡眠呼吸暂停的相关性。2. SIRT1信号传导通路干预对大鼠睡眠呼吸暂停影响研究：选择成年大鼠，对其进行睡眠检测，评价其睡眠呼吸暂停程度。之后喂食SIRT1的激动剂和抑制剂，对比观察睡眠呼吸暂停的情况。并检测脑干中神经元凋亡及SIRT1、CREB、BDNF、NOS、5-HT受体1B/2A/2C表达水平，比较分析这些变化与睡眠呼吸暂停的相关性。利用微透析技术，分别对自由活动大鼠第四脑室灌入SIRT1、BNDF、

42、NOS、5-HT1B/2A/2C受体等的特异性激动剂和抑制剂，观察干预前后大鼠睡眠呼吸暂停的变化及交互影响。3. SIRT1信号传导通路干预对舌下神经元电活动的影响研究：利用微透析技术，向成年全麻下大鼠第四脑室内分别灌入SIRT1、BNDF、NOS、5-HT1B/2A/2C受体等的特异性激动剂和抑制剂，观察大鼠颏舌肌电活动的变化。制作大鼠活脑片，在红外显微镜下进行舌下神经核运动神经元电压钳检测，通过给予SIRT1、BNDF、NOS、5-HT1B/2A/2C受体等的特异性激动剂和抑制剂，观察舌下神经核神经元电活动的变化及交互影响。4. SIRT1激动剂/抑制剂对脑干神经元5-HT调节的离体研究：

43、分离脑干的运动神经元细胞，进行原代培养，分别给予SIRT1、BNDF、NOS等的激动剂和抑制剂观察神经元凋亡情况及5-HT1B/2A/2C受体的表达水平及交互影响。5. SIRT1表达水平对大鼠脑干5-HT能神经细胞的影响：分离脑干的运动神经元细胞，进行原代培养，分别给予将SIRT1基因及其干扰RNA转入神经元，并分别加入BNDF、NOS等的激动剂和抑制剂观察神经元凋亡情况及5-HT1B/2A/2C受体的表达水平及交互影响。研究目标：通过本研究揭示SIRT1与睡眠呼吸暂停的相关性及其因果关系，阐明衰老相关基因SIRT1可以直接或间接地调控中枢5-HT/5-HT受体系统的表达和功能，进而导致呼吸

44、中枢调控的不稳定，从而影响大鼠睡眠呼吸暂停的发生。 拟解决的关键科学问题：目前虽然我们前期研究及其他学者的研究已经表明，5-HT及其受体系统是睡眠呼吸暂停发生的重要调节系统，但其上游如何进行调控目前并不清楚。这造成人类对睡眠呼吸暂停发生机制，尤其是更高级调节机制难以阐明，因此我们还无法认识睡眠呼吸暂停发生的本质，这也是造成目前难以研发相应治疗药物的关键所在。通过现有研究我们有理由相信老化相关因子SIRT1与5-HT及其受体存在调控关系，而这也与睡眠呼吸暂停随增龄而增多的现象相吻合。这强烈提示睡眠呼吸暂停的发生与衰老相关调控机制相关。从衰老相关机制入手去研究睡眠呼吸暂停的发生，是开启了睡眠呼吸暂

45、停发生机制研究的一扇新的窗口，有助于解释为睡眠呼吸暂停大鼠5-HT及其受体会在出现异常的原因，从而使我们更够更深入地去认识和探讨睡眠呼吸暂停发生的本质。通过本研究我们拟解决下列关键科学问题：1、睡眠呼吸暂停的发生是否与SIRT1表达相关；2、SIRT1对睡眠呼吸暂停的影响是否通过5-HT及其受体系统；3、SIRT1和5-HT及其受体系统之间通过何种信号通路影响睡眠呼吸暂停的发生。在本研究的实施过程中需要解决的关键技术问题包括活脑片膜片钳技术、自由活动大鼠微透析技术，这些技术在我们前期的国家自然科学基金项目中均已成功应用。本研究中将使用的转基因及干扰RNA技术是本研究尚需要解决的关键技术问题。但

46、本研究依托我院的中心实验室的硬件和技术平台，该中心实验室具备进行转基因及干扰RNA设计、载体制备、细胞转染的经验、技术和相关设备，这将解决这一技术难题。拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）研究方法和实验手段：自由活动大鼠的多导睡眠监测及分析技术脑组织的免疫组织化学染色、脑组织mRNA的原位杂交技术图像分析技术活脑片的制备及红外直视下膜片钳技术在体、自由活动大鼠的脑内微透析技术颏舌肌肌电记录及分析技术原位杂交技术RT-qPCR检测mRNA表达技术Western杂交检测蛋白之技术关键技术：脑室微透析技术(central mircodialysis )：

47、在大鼠脑立体定位仪的引导下，在第四脑室/侧脑室埋置微透析电极。术后恢复一周。脑室给药前，拔出微透析探针的内芯，将套管通过接头和微透析管连接微透析泵。大鼠脑片制作与培养： SD大鼠消毒后断头，打开颅骨，取出脑干，在无菌条件下水平切成横切片，在解剖显微镜下分离成单片，放入培养皿孵育备用。神经元全细胞膜片钳记录：拉制玻璃毛细管微电极并抛光。将培养的脑片移入脑片槽中，室温下氧饱和的ACSF 灌流。在红外显微镜观察下，利用推送器逐渐将电极向脑片推送至封接，设置可调的钳位电压(Clamping voltage)，记录跨膜电流的变化。乳鼠延髓神经元培养：取出生3d的SD大鼠, 于无菌操作下取出延髓, 进行胰

48、酶消化分离延髓5-HT能神经元，置于用兔抗N-CAM抗血清处理过的培养皿内进行培养纯化。继续培养24、48和72h观测生长状况良好后进行研究。干扰RNA的制备：根据SIRT基因序列及shRNA设计原则设计并合成4对针对目的基因CDs区的Oligo DNA序列；在其末端连接一段FAM(红色荧光)；将其转入脂质体运载系统中；加入细胞培养液中，在显微镜下通过观察细胞中红色荧光的情况，判断转染效率；进行 RNAi 效果验证，通过 RT-qPCR 检测 SIRT1mRNA水平,通过 Western blotting 进行蛋白质水平的验证，筛选出 4 个 shRNA载体中干扰效果最佳的一个 shRNA载体

49、进行后续研究。SIRT1基因转移：将SIRT1的cDNA进行修饰;5端连接强启动子（CMV的启动子）；在末端连接绿色荧光蛋白;与质粒连接构建载体后，导入脂质体中通过在显微镜下通过观察细胞中绿色荧光的情况，判断转染效率。TUNEL法检测神经元凋亡: 留取脑干冰冻组织切片；用4%多聚甲醛固定细胞并用PBS清洗孵育，经Triton X-100冰浴孵育及过氧化氢-甲醇溶液中室温孵育；洗涤后加TdT酶缓冲液，加TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应；将切片置于染色缸中进行染色；加过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应；加新鲜DAB溶液，室温显色；用甲基绿进行复染，脱水、封片、干燥后，在光学显微镜下

50、观察。技术路线：1.SIRT1在大鼠呼吸中枢表达及与睡眠呼吸暂停关系的研究：选择SD大鼠为研究对象，分别选择成年大鼠（月龄3个月）和老年大鼠（月龄18-24个月）；行手术埋放脑电和肌电电极；术后12-12 小时人工昼夜节律饲养恢复7天后进行睡眠监测，计算睡眠结构和睡眠呼吸暂停，计算呼吸暂停指数；监测后处死，部分大鼠取低位脑干TUNEL法检测神经元凋亡；部分大鼠低位脑干进行SIRT1、CREB、BDNF、NOS、5-HT受体1B/2A/2C免疫组织化学染色和mRNA原位杂交；进行图像分析；另一部分大鼠监测后处死，取低位脑干提取蛋白和mRNA进行定量分析检测脑干中SIRT1、CREB、BDNF、N

51、OS、5-HT受体1B/2A/2C表达水平；分析蛋白表达和mRNA表达与大鼠月龄及睡眠呼吸暂停严重程度的关系。2、SIRT1信号传导通路干预对大鼠睡眠呼吸暂停影响研究：选择成年SD大鼠，对其进行睡眠监测，评价其睡眠呼吸暂停程度；分三组，分别胃肠道给予SIRT1的激动剂、抑制剂、生理盐水7天；观察睡眠呼吸暂停的情况；监测后处死，部分大鼠取低位脑干TUNEL法检测神经元凋亡；部分大鼠低位脑干进行SIRT1、CREB、BDNF、NOS、5-HT受体1B/2A/2C免疫组织化学染色和mRNA原位杂交；进行图像分析；另一部分大鼠监测后处死，取低位脑干提取蛋白和mRNA进行定量分析检测脑干中SIRT1、C

52、REB、BDNF、NOS、5-HT受体1B/2A/2C表达水平；比较各组间的表达差异并分析这些因子的表达与睡眠呼吸暂停的相关性。利用离体定位技术对正常饲养的成年SD大鼠第四脑室内植入微透析导管，术后让其自由活动进食；分别对自由活动大鼠脑室灌入SIRT1、BNDF、NOS、5-HT1B/2A/2C受体等的特异性激动剂和抑制剂；观察干预前后大鼠睡眠呼吸暂停的变化及交互作用；综合分析SIRT1CREBBNDF/NOS5-HT受体通路对睡眠呼吸暂停的影响3、SIRT1信号传导通路干预对舌下神经元电活动的影响研究：选择正常饲养的成年SD大鼠，进行全身麻醉；利用立体定位技术，分别向成年大鼠第四脑室植入微透

53、析导管；分别注入SIRT1、BNDF、NOS、5-HT1B/2A/2C受体等的特异性和抑制剂；观察大鼠颏舌肌肌电活动的变化。另选正常饲养的SD乳鼠，制作活脑片；在红外显微镜下应用应用膜片钳技术，记录全细胞的兴奋性及动作电位；通过给予SIRT1、BNDF、NOS、5-HT1B/2A/2C受体等的特异性激动剂和抑制剂；观察舌下神经元兴奋性变化及其交互作用；综合分析SIRT1CREBBNDF/NOS5-HT受体通路对舌下神经核及舌下神经电活动的影响。4、SIRT1激动剂、抑制剂对脑干神经元5-HT调节的离体研究：选择SD乳鼠，处死后分离脑干运动神经元，进行原代培养；分组分别给予SIRT1激动剂和抑制

54、剂；观察CREB、BDNF、NOS、5-HT受体1B/2A/2C表达水平在激动剂组、抑制剂组及对照组的差别；给予SIRT1激动剂和抑制剂的基础上，再分别加入BNDF的诱导剂和阻滞剂、NOS的诱导剂和抑制剂；观察神经元CREB、BDNF、NOS、5-HT受体1B/2A/2C的mRNA和蛋白表达水平，了解其交互效应。5. SIRT1表达水平对脑干5-HT能神经元调节的离体研究：选择SD乳鼠，处死后分离脑干运动神经元，进行原代培养分组分别将SIRT1基因及干扰RNA转入培养细胞（设计及构建见研究技术）（3）观察CREB、BDNF、NOS、5-HT受体1B/2A/2C表达水平在转基因组、干扰RNA组及

55、对照组的差别（4）在SIRT1基因及其干扰RNA转入神经元的基础上，再分别加入BNDF的诱导剂和阻滞剂、NOS的诱导剂和抑制剂（5）观察神经元SIRT1、CREB、BDNF、NOS、5-HT受体1B/2A/2C的mRNA和蛋白表达水平，了解其交互效应。本研究中使用的关键工具药：激动剂抑制剂SIRT1resveratrolsirtinolNOSL-精氨酸7-硝基吲唑/L-NG-硝基精氨酸甲酯BDNF7,8-dihydroxyflavoneTrKB-IgG5-HT1BRu24969/CGS12066BGR127935/methiothepin5-HT2A2,5-二甲氧基-4-碘苯基丙烷（DOI）酮

56、舍林5-HT2CM-110/WAY 161503SB-242084技术路线简图：成年SD大鼠（3月龄）老年SD大鼠（18月龄）睡眠呼吸监测测定NO、SirT1、5-HT1B、5-HT2A、5-HT2C蛋白的表达；分析相关性、比较差异。睡眠呼吸监测中枢给予SIRT1 激动剂、5-HT 受体的拮抗剂、激动剂SD乳鼠（3天）延髓神经元原代培养全细胞记录 中缝核的兴奋性及动作电位正常对照组观察CREB、BDNF、NOS和5-HT受体的表达情况SIRT1基因转染组SIRT1基因RNAi干扰组脑片孵育液中加入SIRT1的拮抗剂和激动剂脑干切片 活脑片制备全细胞记录 中缝核的兴奋性及动作电位SIRT1激动剂

57、组再分别加入BDNF和NOS的激动剂和抑制剂神经元凋亡检测；5-HT1B、5-HT2A、5-HT2C蛋白的表达检测，了解其交互效应SIRT1抑制剂组可行性分析理论假说的可行性：接镜r微镜下进行舌下神经核运动神经元电压钳检测，睡眠呼吸暂停随年龄增加而患病增多这是不争的事实，而SIRT1作为衰老基因的重要一员也已得到公认。睡眠呼吸暂停的中枢异常是主要的发病机制，而其中5-HT及其受体系统在其中扮演着重要角色。目前SIRT1与其他中枢系统疾病的关系已经明确，而且也有研究证明其对5-HT系统有调控关系。因此将SIRT1作为睡眠呼吸暂停发生的可能关键环节之一，作为5-HT及其受体系统的上游调控因子去研究

58、有着非常坚实的科学依据。因此，本研究的理论假说科学上有依据，理论上合理，研究上可行。2 研究技术的可行性：本研究中涉及的关键技术具有可行性，所需试剂及设备已具备或可以在国内购买。SD大鼠具天然的中枢型睡眠呼吸暂停，非常适合于研究睡眠呼吸暂停的中枢化学调控。我们研究室曾对其睡眠结构和呼吸暂停的特点进行过研究（王菁，2004，2005）。其睡眠结构与人类非常类似，可象人类一样监测到呼吸暂停并且呼吸暂停的在各个睡眠期的分布也与人类类似。因此选择SD大鼠为研究对象是可行的。我科呼吸研究室已建立了大鼠的多导睡眠呼吸监测、睡眠分析及呼吸暂停检测技术，并进行了相应的实验研究，研究的部分结果已发表。这些技术方

59、法实用、可靠。免疫组织化学技术及mRNA原位杂交技术、蛋白和mRNA的定量检测技术是常规的免疫学和分子生物学技术，在我科的实验室及中心实验室均可进行过这方面的研究工作。我科也有多年这方面的研究经验。膜片钳技术是本研究实施过程中的技术难点，我科完全掌握了活脑片的制备技术。我院中心实验室配备了带红外显微镜的直视膜片钳设备，其操作成功率更高。加之本研究组成员中有经验丰富、进行膜片钳研究工作多年的技术专家进行指导，完全可以成功完成相关研究。神经核定位技术、神经核团和脑室微透析技术也是本研究成功的技术关键。但这些技术为神经生理研究的常用技术，目前我们已购买了微透析设备并已建立了相应得实验方法，因此也不存在技术上的障碍。转基因及干扰RNA技术是本研究的另一技术难点，但我院中心实验室曾经进行过相关的研究工作，有技术储备。借助我院中心实验室平台的人员、设施、技术和经验，完全可以完成本研究。本研究使用的相关的激动剂、阻滞剂等关键试剂可通过购买获得。本项目的特色与创新之处。睡眠呼吸暂停有随年龄增加患病增加的现象，提示与老化可能有关。也有研究证明SIRT1是重要的老化相关因子。而目前国内外的研究均未将呼吸暂停与SIRT1通过衰老机制联系起来。本研究主要的特色和创新之处就在于将与老化有关的睡眠呼吸暂停与老化重要的调节因子联系起来。从一个全新的视角去审视和研究睡眠呼吸暂停的机制，是这一领域 一个重要创