分子生物学 题库汇总

1、名词解释：1基因（gene）：是一段携带功能产物（多肽，蛋白质，tRNA和rRNA和某些小分子RNA）信息的DNA片段，是控制某种性状的的遗传单位。2基因组（genome）：泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。3、端粒:以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。4、操纵子:是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。

2、5、顺式作用元件:是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等。6、反式作用因子:是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子在反式作用因子中，可直接或间接结合RNA聚合酶的，称为转录因子。转录调节因子结构DNA结合域酸性活域脯氨酸富含域TF转录激活域谷氨酰胺富含域蛋白质-蛋白质结合域（二聚化结构域）7、启动子:是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。8、增强子:位于真核基因中远离转录起始点，能明显增强启动子转录效率的特殊DNA序列。它可位于被增强

3、的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。9、基因表达:是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。10、信息分子:调节细胞生命活动的化学物质。其中由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质称为细胞间信息分子；而在细胞内传递信息调控信号的化学物质称为细胞内信息分子。11、受体:是存在于靶细胞膜上或细胞内能特异识别生物活性分子并与之结合，进而发生生物学效应的的特殊蛋白质。12、分子克隆:在体外对DNA分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量

4、拷贝。13、蛋白激酶:是指能够将磷酸集团从磷酸供体分子转移到底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。14、蛋白磷酸酶:是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。15、基因工程:有目的的通过分子克隆技术，人为的操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。16、载体:能在连接酶的作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。17、转化:指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入细菌的过程。18、感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力

5、的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。19、转导:指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。20、转染:指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。21、DNA变性:在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。22、DNA复性:当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。23、退火:指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。24、筑巢PCR:先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，

6、再用内侧引物以大片段为摸板扩增获取目的基因。可以提高PCR的效率和特异性。25、原位PCR:以组织固定处理细胞内的DNA或RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程。26、定量PCR:基因表达涉及的转录水平的研究常需要对mRNA进行定量测定，对此采用的PCR技术就叫定量PCR。27、基因打靶:是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。128、DNA芯片:DNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可获得样品的遗传信息。由于常用计算机

7、硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。29、错义突变:DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种的氨基酸，使得多肽链中的氨基酸顺序也相应的发生改变的突变。30、无义突变:由于碱基对的取代，使原来可以翻译某种氨基酸的密码子变成了终止密码子的突变。31、同义突变:碱基对的取代并不都是引起错义突变和翻译终止，有时虽然有碱基被取代，但在蛋白质水平上没有引起变化，氨基酸没有被取代，这是因为突变后的密码子和原来的密码子代表同一个氨基酸的突变。32、移码突变:在编码序列中，单个碱基、数个碱基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突变位点之后的三联体密码

8、阅读框发生改变，不能编码原来的蛋白质的突变。33、癌基因:是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。当癌基因结构或表达发生异常时，其产物可使细胞无限制增殖，导致肿瘤的发生。包括病毒癌基因和细胞癌基因。34、细胞癌基因:存在于正常的细胞基因组中，与病毒癌基因有同源序列，具有促进正常细胞生长、增殖、分化和发育等生理功能。在正常细胞内未激活的细胞癌基因叫原癌基因，当其受到某些条件激活时，结构和表达发生异常，能使细胞发生恶性转化。35、病毒癌基因:存在于病毒(大多是逆转录病毒)基因组中能使靶细胞发生恶性转化的基因。它不编码病毒结构成分，对病毒无复制作用，但是当受到外界的条件激活时可

9、产生诱导肿瘤发生的作用。36、基因诊断：以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、结构缺陷或表达异常，对人体的状态和疾病作出诊断的方法和过程。37、RFLP:即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。若因此而改变了限制性内切酶的酶切位点则可导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。38、基因治疗:一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的治疗方法。39、反义RNA:碱基序列正好与有意义的mRNA互补的RNA称为反义RNA。可以作为一种调控特定基因表达的手段。40、核酶:是一种可以催化RNA切割和R

10、NA剪接反应的由RNA组成的酶，可以作为基因表达和病毒复制的抑制剂。41、三链DNA:当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘌吟区可结合形成三链，能特异地结合在DNA的大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成氢键。42、SSCP:单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。43、管家基因:在生物体生命的全过程都是必须的，且在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因。44、基因表达就是基因的转录及翻译，也包括RNA基因的转录。基因表达的规律性包含时间特异性和空间特异性。基因表达的方式有组成性表达及

11、可诱导或可阻遏表达。诱导和阻遏表达：可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induetion)。如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。基因表达的调控(controlofgeneexpression)是指对基因组中某一个基因或一些功能相近的基因表达的开启、关闭和表达强度的直接调节。它是生物在进化过程中逐渐形成的精确而灵敏的生存和应变能力。原核生物基因表达转录激活调控通常通过操纵子模式实现，并且以负性调节为主。而真核生物基因表达调控则更复杂，多是通过反式作用因子(转录调节因子)与顺式反应元件(启动子、增强子

12、、沉默子)的相互作用而实现的，大多数是正性调节。45、SD序列:转录出的mRNA要进入核糖体上进行翻译，需要一段富含嘌吟的核苷酸序列与大肠杆菌16SrRNA3,末端富含嘧啶的序列互补，是核糖体的识别位点。46、反义核酸技术:是通过合成一种短链且与DNA或RNA互补的，以DNA或RNA为目标抑制翻译的反义分子，干扰目的基因的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。47、核酸探针:探针是指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。核酸探针是指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段DNA或RNA分子。48、周期蛋白:是一类呈细胞周期特异性或时相性表达、累积与分解的蛋白质，它

13、与周期素依赖性激酶共同影响细胞周期的运行。49、CAP:是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递个许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖时可以利用其他碳源。50、顺反子(cistron)在反式构型中不能互补的各突变型所占有的那部分DNA片断(见互补测验)。51、结构域是指超二级结构在空间上进一步聚集形成的紧密稳定的在蛋白质分子上明显可分的类似球状的结构。252、分子生物学(molecularbiology)是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的学科。53、医学分子生物学从分子水平上研究人体在正常和疾病状态下的生命活动及其规律，从分子水平开展人类疾病的预防、诊断

14、和治疗研究的一门科学。53、抑癌基因是指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，当这类基因在发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。54、基因文库(genelibrary，genebank)利用限制性内切酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入到宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为基因文库。55、cDNA文库将cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样

15、一个混合体就称为cDNA文库。56、表达载体(expressingvector)是用来在受体细胞中表达(转录和翻译)外源基因的载体。这类载体除具有克隆载体所具备的性质以外，还带有表达构件一一转录和翻译所必需的DNA序列。真核细胞病毒做载体；原核细胞质粒、噬菌体做载体57、重组DNA技术采用载体基因与某目的基因在体外重组的方法克隆DNA的技术，称为重组DNA技术。过程包括：目的基因的获取、基因载体的选择与构建、目的基因与载体的拼接、重组DNA分子导入受体细胞、筛选并无性繁殖含重组体分子的受体细胞以及阳性克隆的表达。58、C值佯谬：这种生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象称为C值佯谬

16、(Cvalueparadox)；59、基因家族(genefamily)概念:指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定同源性的一些基因。基因组学(genomics):发展和应用基因作图、DNA测序、基因定位等新技术以及计算机程序，分析生命体(包括人类)全部基因组结构及功能。61.分子伴侣：是细胞一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。信号肽：各种新生分泌蛋白的N端有保守的氨基酸序列称信号肽。细胞凋亡(apoptosis)(有树叶凋零之意)或程序化细胞死亡(programmedcelldeath,PCD)是指多细胞有机体在正常生理或病理情况下，发生的一种由多基因控制

17、的主动死亡过程。凋亡小体:指凋亡的最后阶段，由胞质分割形成大小不等，含有细胞质膜、细胞器及核碎片的膜包被小体。65.DNA片段化(主)：凋亡细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳呈特征性梯状条带图谱66死亡受体（deathreceptors,DR）:指细胞表面存在的一类能结合凋亡剌激分子，并将信号传递至胞内引起细胞凋亡的受体67.“死亡结构域”概念：是凋亡信号受体共有的、存在于胞内的转导细胞凋亡所必需的一段高度同源的aa序列。68周期蛋白框:各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。检验点：意指当DNA受到损伤时，复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断

18、。蛋白质组的含义：一个基因组、一种生物或一种细胞/组织所表达的全套蛋白质蛋白质组学就是从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域酵母双杂交系统:是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。报道株:经改造的、含报告基因的重组质粒的宿主细胞。73克隆（clone）:来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。克隆化（cloning

19、）:获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖DNA克隆:应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，又称基因克隆（genecloning）或分子克隆（molecularcloing）。载体（vector）：能携带外源基因进入受体细胞，并在其中进行扩增或诱导外源基因表达的工具。77.质粒:细菌染色质以外的双链环状DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息。78限制性核酸内切酶:由细菌自己产生的一种能识别

20、和切割DNA内部特定序列的一类核酸酶基因组文库（genomiclibrary，G文库）：用基因克隆的方法保存宿主细胞中的DNA重组分子中的集合，所有重组子所含的插入片段的总和代表某种生物基因组全部核苷酸序列。cDNA文库（cDNAlibrary，C文库）：用基因克隆的方法保存在宿主细胞中的DNA重组体的群体，每一重组子只含一种mRNA信息，这些重组子的总和包含某种生物的全部mRNA序列。定向克隆:将外源DNA片段定向插入到载体中的方法3TA克隆定义:利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性（在7075C活性高），使PCR产物的3Z末端加一个A的粘性端，将其直接克隆至3粘性末端含

21、一个T的线性克隆载体中.宿主细胞：被导入重组分子的细胞转化:质粒DNA或以质粒为载体构建的重组DNA导入细菌的过程感受态细胞:用理化方法人工诱导细胞，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，转导:通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程。核酸分子杂交:用一已知的DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知的核苷酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原理互相结合，再经显影或显色的方法，将结合核苷酸序列的位置和大小显示出来。探针:用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的DNA片段或RNA片段89.Southern印迹杂交:是将经凝胶分离的DNA转移到合适的固相支持物，再通过特异性探针

22、的杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。Northern印迹杂交:将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到NC膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。核酸原位杂交:以特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的方法，又称原位杂交组织化学或杂交组织化学。.反转录PCR（RT-PCR）:是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术表位标签:亦称附加表位由短肽序列组成的能显示抗体存在的一个表位，广泛用于分子生物学中附加到转基因蛋白中翻译产物为融合蛋白，通过免疫组化或Western印迹杂交跟踪其表达，不会增加抗体对特异蛋白

23、的反应。93:基因芯片技术:用已知序列的探针与样品cDNAs杂交，杂交信号阳性的探针序列即为细胞中表达的DNA序列消减杂交法:将实验组mRNA（或cDNA）与对照组cDNA（或mRNA）杂交，去除杂交体和未杂交上的对照组成分（cDNA或mRNA）,得到的为实验组独有的mRNA或cDNA，这些基因即是差异表达基因。基因治疗:用正常或野生型基因校正或置换致病基因的一种治疗方法称基因治疗基因疗法:治疗过程中应用的目的基因就像平常临床上使用的药物一样，为了与传统意义上的基因治疗相区别，通常称之为基因疗法。VNTR多态性:不同个体间重复单元如（CA）n/（TG）n的拷贝数（即出现的频率）不同，因而产生多

24、态性，称为VNTR多态性。生物芯片：在可识别的有序点阵集合上，试样与每个点阵发生分子间反应或杂交后，通过扫描检测同时获得各个点阵上的作用信息。分子生物学大题一、基因与基因组鉴别蛋白质编码基因的五项标准：（1）.开放阅读框（openreadingframe,ORF）:是始于起始密码子并终于终止密码子的一串密码子。;（2）.序列特征一一密码子偏爱和剪接点；（3）.序列保守性；（4）.转录产物:寻找基因的表达产物一一RNA或蛋白质.；（5）.基因失活。2真核生物基因组特点：（一）分子量很大的DNA与蛋白质形成染色体存在于核内。（二）转录与翻译不同步，转录产物为单顺反子，功能相关基因分散排布，无操纵子

25、结构。（三）基因组存在高比例的非编码序列（noncodingsequence,NCS）,NCS可作进化标尺。（四）大量重复序列（repeatsequence）存在。（五）基因多为不连续的，被插入序列（IS）所分隔（这种现象称为断裂基因（splitgene）.断裂基因由内含子（intron）（非编码序列）和外显子（exon）（编码序列）交替组成。（六）功能相关基因构成各种基因家族3重复顺序的功能：1）编码某些重要的功能性蛋白、rRNA、tRNA等；2）与染色体构象、着丝粒形成有关；3）参与基因的表达调控.分类：1）倒位（转）重复顺序：指两互补顺序呈反向排列，形成回文结构或发夹状结构；2）串连重复

26、顺序：由相同的核心顺序（270bp）成串（头尾相接）排列而成的高度重复顺序。3）散在重复顺序。人类基因定位的基本方法:（1）.家系分析法发现感兴趣的基因。通过分析统计家系中有关遗传性状的连锁情况和重组率而进行基因定位的方法。；（2）.体细胞杂交初步的基因定位；（3）.核酸杂交技术精确的基因定位。克隆基因定位法；原位杂交法；原位PCR；定位克隆技术。基因论：1）相引是两个基因位于同一染色体上，相斥则反之；2）同源染色体在减数分裂时发生交换；3）位置相近的因子相互连锁。HGP的主要成果四张图：1）遗传图:第一代遗传标记是RFLP（restrietionfragmentlengthpolymorph

27、ism,限制性酶切片段多态性）；第二代遗传标记是STR（shorttandemrepeat，简短串连重复序列），6000个标记；第三代遗传标记是SNP（restrictionfragmentlengthpolymorphism，单核苷酸多态性），不再是分析长度，而是直接测序2）物理图：以一段已知序列的DNA片段（STS，sequencetaggedsite，序列标记位点）并有染色体定位为路标，以Mb或Kb为图距的基因组图。3）转录图又称表达序列图或cDNA图的路标:是以部分5端或3端cDNA序列（即表达序列标签，EST）为路标，根据表达顺序的位置和4距离作图4）序列图：测定总长约30亿个核苷酸

28、组成的全染色体序列。7五大模式生物：E.coli、酿酒酵母、黑腹果蝇、秀丽线虫和小鼠，其序列分析被列为HGP的内容；&DNA多态性及其意义：DNA多态性:除同卵双生的两个体外，没有两个人的DNA组成是完全相同的，即人类DNA组成具有多态性。如果比较随机的十个人的常染色体的非编码区就会发现约200400bp就有一个核苷酸不同，这些可变区域即称为DNA多态性（DNApolymorphism）位点。DNA多态性标记的价值：1）为路标，构建DNA标记的遗传连锁图谱;2）使遗传图谱从直接可见的表型多样性标记进步到DNA分子本身多态性标记。DNA多态性的种类：1）DNA位点的多态性；2）串连重复顺序多态性

29、；3）单核苷酸多态性细胞凋亡的生物学意义：1）具有清除个体发育过程及成熟个体中多余细胞及老化细胞的机体调节作用；2）具有消除对机体有害的癌变细胞及病毒感染细胞的机体防御作用。细胞凋亡是维持个体生存所必需的一种生物学机制。Caspase的性质和种类：Caspase即天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶。1）已在哺乳类中发现14种，分为3个亚类：CaspaseT亚家族，Caspase-2亚家族，Caspase-3亚家族；2）根据前体分子（procaspase）N端的原结构域（prodomain）分为2类:启始分子（initiator）,如-8、-9、T0等，为蛋白酶级联反应的启始者，其活化后再切割和活化下

30、游Caspase；效应分子（effector），如-3、-6、-7等，作为上游酶的底物被切割活化，再作用于多种蛋白质或酶，促使细胞凋亡。效应caspase引起细胞凋亡的机制：1）灭活细胞内凋亡抑制蛋白：非凋亡细胞中，CDA（caspase活化的DNAase）与其抑制蛋白（ICDA）结合;凋亡细胞中，caspase剪切ICDA;CDA游离并进入核内降解DNA，细胞凋亡.2）剪切细胞结构蛋白：如Caspase对核板的降解作用；在凋亡过程中，caspase在单一位点剪切核纤层蛋白（lamin）,导致核板塌陷，染色质浓缩.3）剪切效应蛋白：如参与基因表达蛋白因子，如PARP;4）活化caspase抑制

31、剂。细胞凋亡的信号传递通路的特点:（1）.同一性：各种因素引起的凋亡的形态与生化改变均相同。（2）.多样性：环境因素不同，细胞类型不同，或刺激因素不同时，从凋亡程序启动到凋亡发生，其信号传递途径是不同的。（3）.分类：百余种凋亡调控因子，正逐渐被组装成一条条的信息传导通路，可分为基本传导通路和非专一性传导通路二类。6细胞凋亡的信号传递途径：（1）死亡受体介导的细胞凋亡；（2）线粒体相关蛋白的凋亡诱导途径：线粒体跨膜电位（m）的下降，线粒体膜通透性转运孔（MPT）破坏或开放，开放的后果是，AWm下降、氧化磷化脫偶联、GSH耗竭、ROS产生等，并形成恶习性循环。；（3）细胞核凋亡诱导途径；（4）粒

32、酶B介导的细胞凋亡：CrB由CTL分泌进入靶细胞胞浆后，其丝氨酸蛋白酶在胞浆pH7.0条件下发挥最佳活性，切割胞浆和核中的多种底物；Caspase依赖的死亡通路是CrB介导细胞死亡的重要途径之一。P53蛋白的调控作用：自N端起包括：转录活化区、DNA结合区、四聚体化区和C-调节区；1）P53的表达与活性调节。正常状态下：胞浆P53水平很低，半衰期很短；胞内P53被严格监控，受HDM2的负反馈调节，并通过泛素降解途径调节P53水平。异常情况下：当细胞DNA损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常表达等细胞生存面临威胁时；P53水平迅速升高和活化；2）P53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用：野生型P53蛋白具

33、维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用；P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转；如果损伤不能修复，P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。突变型P53蛋白：丧失抑制细胞恶性增殖功能，p53基因突变是50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因;并且本身具有癌基因功能。&Bcl-2家族的功能：（1）属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化无影响（2）阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。如Bcl-2能阻止由r射线和多种化疗药导致的细胞凋亡。（3）Bcl-2蛋白具抗氧化作用;（4）Bcl-2蛋白抑制细胞器内Ca2+离子向胞质释放，而凋亡

34、必须有Ca2+离子参与。bcl-2家族成员：1）抑制凋亡：bcl-2，bcl-xL，MclT。2）促进凋亡：bax，bcl-xs，bad。Bcl-2家族对细胞凋亡的调节机制：（1）Bcl-2、Bax和Bcl-x组成一个凋亡调控系统；（2）当Bax/Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡；（3）.随bcl-2表达量增加，渐多的Bax/Bax解聚，形成更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，从而中和了Bax/Bax诱导凋亡的作用。即Bax和Bcl-2比值调节凋亡；（4）当Bcl-xs存在时，优先形成Bcl-xs/Bcl-2，使Bax/Bax形式保留，诱导细胞凋亡。原位末端标记技术（insituend

35、-lableing，ISEL）:原理：ISEL的原理是基于细胞凋亡时，DNA断裂，利用末端脫氧核苷酸转移酶（TdT）或DNA聚合酶将带有生物素标记的核苷酸（biotin-16-dUTP）掺入到断裂的DNA的3端，再使其与带有辣根过氧化物酶的抗生物蛋白结合，经DAB显色后，便可观察到细胞内是否存在DNA片段端存在。主要方法有2种：1）.TdT介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）；2）.DNA聚合酶I或klenow大片段介导的原位的缺口平移（ISNT）。该法特异性和敏感性较高，可检出早期的凋亡细胞.与细胞凋亡减少有关的疾病：1）.癌症；2）.自身免疫性疾病，红斑浓疮，免疫介导的肾小管肾炎。3）

36、.病毒感染与细胞凋亡增加有关的疾病：1）.AIDS；2）.神经退行性病变，帕金森病，老年痴呆；3）再生性障碍贫血；4）缺血性损伤，心肌梗塞，脑卒中，再灌注损伤；5）.酒精肝细胞凋亡自身免疫性疾病：正常情况下：1）90%以上的淋巴细胞在胸腺内发育都会发生凋亡，那些能识别自身抗原的细胞都应被清除，确保被选择生存下来的淋巴细胞不至于对自身抗原产生免疫应答；2）如果这种选择性清除失败，在靶细胞存在下，淋巴细胞被激活，产生5大量的效应细胞攻击靶细胞，导致发生自身免疫性疾病。发病的分子机制：1）淋巴细胞中调节细胞凋亡的一个关键分子是细胞表面受体Fas（又称APO或CD95）,Fas受体与FasL（配体）结

37、合即可激活凋亡信号传导途径，细胞凋亡；2）T细胞表面受体Fas和FasL发生突变时，T细胞不能发生正常凋亡，导致自身免疫性疾病。3）除系统性红斑狼疮外，还证实类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病、牛皮癣均与淋巴细胞凋亡敏感性改变（Fas和FasL突变）有关。细胞凋亡病毒性疾病：病毒的溶解性感染所产生的细胞病变变作用与引发细胞凋亡有关；而病毒的持续性感染与病毒抑制细胞凋亡有关。1）病毒感染引发细胞凋亡：牛疱疹病毒、鸡白血病毒和HIV等，均能通过诱导细胞凋亡而引起宿主细胞缺失。如HIV感染后引起CD4+T细胞凋亡而缺失。2）病毒感染抑制细胞凋亡：许多病毒具有抑制细胞凋亡的机制，有利于建立持续感染、延长

38、病毒复制时间、以最大限度产生子代病毒。如EB病毒产生LMP-1,使Bcl-2基因上调；牛痘病毒产生crmA,可抑制由caspase所介导的细胞凋亡。15细胞凋亡与肿瘤：肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常疾病，同时也是细胞凋亡异常疾病。1）大多数肿瘤P53突变、而有些肿瘤过度表达Bcl-2蛋白，这些可有效地以避免细胞凋亡发生。2）P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转。如果损伤不能修复，P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。3）Bcl-2属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命。三、细胞周期调控：1细胞周期：1）间期：G1期（合成前期）

39、；S期（DNA合成期）；G2期（合成后期）。2）分裂期：前期；中期；后期；末期。2细胞周期调控的主要分子机制：细胞周期引擎一一异二聚体蛋白激酶复合体，包括二个亚单位：1）调节亚单位：细胞周期蛋白，其浓度随细胞周期不断变化，不仅起激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化；2）催化亚单位：细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK），单独存在时无活性，与cyclin结合才具有蛋白激酶的活性。参与细胞周期调控的分子：1）异二聚体蛋白激酶复合体；2）生长因子；3）泛素与APC:泛素由76个氨基酸组成，高度保守，普遍存在于真核细胞，故名泛素；泛素相当于蛋白质被摧毁的标签。4）周期蛋白依赖性激

40、酶抑制因子（CKI）3细胞周期的运行：1）细胞周期的启动（G0-G1）；2）DNA复制（G0-S）；3）进入M期（G2-M）；1）细胞周期的启动：细胞在生长因子的刺激下，CyclinD表达，与CDK4、CDK6结合而活化激酶?下游蛋白质磷酸化？促进基因的转录2）DNA复制：CyclinE与CDK2结合-?S-CDK触发前复制复合体（pre-RC）启动，同时阻止DNA再次进行复制.3）进入M期（G2-M）：CyclinA、CyclinB与CDK1结合，形成M-CDK?CDK-Cyclin能够积累？CDK1使底物蛋白磷酸化?细胞分裂.4检验点由感受异常事件的感受器、信号传导通路和效应器构成，主要检

41、验点有4个：1）G1/S检验点：在哺乳动物中称R点（restrietionpoint）,控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括:DNA损伤？细胞外环境适宜？细胞体积足够大？2）S期检验点：DNA复制是否完成？3）G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA损伤？细胞体积足够大？4）中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上，都会抑制APC的活性，引起细胞周期中断。四、蛋白质分离纯化1蛋白质的含量测定方法：1）紫外光谱（A280）吸收法：色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白

42、质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。注意事项：石英比色杯；调零所用溶液；配制标准蛋白所用溶液；光密度范围。Bradford检测法：考马斯亮蓝G-250在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595mn的光吸收值大小计算蛋白的含量。缺点：对各种纯化蛋白质反应不同；这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性。注意事项：标准曲线在2.5ug15ugBSA浓度范围内保持线性关系；反应1015min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性

43、条件下易发生沉淀；若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确。Lowry检测法：在碱性溶液中形成铜蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745750nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。缺点：干扰物质多；反应速度慢；某些试剂不稳定；使蛋白质发生不可逆变性。注意事项：在加入试剂30min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱；许多干扰物质降低颜色反应；高盐浓度可引起沉淀。BCA(二喹啉甲酸)检测法：改进的Lowry测定法，

44、反应简单而且几乎没有干扰物质的影响。原理：在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2+生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。而BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。注意事项：与Lowry相比，采用BCA法时，如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值；为促进BCA法的反应进程，可将样品适当加热。经典的细胞蛋白质分离纯化流程由下述主要步骤组成：6.清洗组织或细胞;(2).裂解细胞;(3).离心除去膜组分等获得可溶性蛋白质;(4).离心、层析、电泳等进一步纯化;(5).获取产物蛋

45、白。包涵体的成份：包涵体是表达蛋白非天然形式的混合物，包括目的蛋白、宿主细胞蛋白及膜蛋白片段，DNA、RNA和质粒编码蛋白以及LPS。包涵体的形成原因：表达蛋白不适当的中间折叠体高浓度聚集在一起形成的不溶物。影响包含体形成的因素：除分子伴侣和折叠酶外；还与蛋白质本身的性质(形成转角的残基数目及平均带电性等)和生长条件(宿主、培养温度、培养基和pH等)有关。防止包涵体形成：降低细胞生长温度；共表达分子伴侣；改变渗透压；融合蛋白包含体中蛋白质的提取：用变性剂使之成为可溶性的伸展的肽链，然后再在适当的条件下复性折叠成天然的、有活性的蛋白质分子。&分离纯化细菌包涵体蛋白的基本步骤：破碎细胞-?分离包涵

46、体-?溶解包涵体(用68mol/L或910mol/L尿素或pH2.04.5酸性溶液)-?蛋白质产物的构型复原影响电泳迁移率的主要因素：(1)带电颗粒的性质：即净电荷数量、颗粒大小及形状;(2)电场强度：指每厘米的电位降，也称电位梯度，或电势梯度；(3)溶液的pH值：决定带电颗粒的解离程度，亦即决定所带净电荷的多少;(4)溶液的离子强度：影响电动电位，缓冲液离子强度越高，电动电位越小，泳动速度慢;(5)电渗：在电场中，由于多孔支持物吸附水中的正或负离子使溶液相对带电，在电场作用下，溶液就向一定的方向移动.(6)支持介质的选择：(7)其它因素：不连续系统原理概要：(1)在不连续电泳系统中，含有三种

47、离子，两种不同孔径的凝胶，两种或两种以上不同pH的缓冲溶液.(2)所谓不连续就是指凝胶浓度不一样，缓冲液离子成分及pH不一样。(3).在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品的浓缩效应、分子筛效应及电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。以下为四个不连续性：(1)凝胶层的不连续性：浓缩胶(stackinggel)；分离胶(separatinggel缓冲液离子成分的不连续性：快离子(前导离子，leadingion)；慢离子(尾随离子，trailingion)；缓冲配对离子(缓冲抗衡离子,thebuffercounterion);(3)电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯

48、度的差异是自动形成的。(4)pH的不连续性：浓缩胶pH：6.7：分离胶pH：&9；缓冲液pH：83。在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。由于电泳基质的上述四个不连续性，使样品在电泳开始时得以浓缩，然后再被分离。12.SDS：SDS作用：1）SDS与蛋白牢固结合，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异；2）SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同，而且具有相同的荷质比，因此在SDS中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与菌、酵母等的破碎。2）SDS物

49、理法：A.超声法：在处理少量样品时操作简便、效率高，液量损失少，适于实验室使用。注意：超声波产生的化学自由基团能使敏感的活性物质变性失活，另外噪声也比较大。B.反复冻融法：由于在此过程中易使活性蛋白失活，故适用于提取非常稳定的蛋白质。C.冷热交替法：绝大多数细胞被破坏，一般适用于从细菌或病毒中提取蛋白质。D.低渗裂解：是指无胞壁细胞在低渗溶液中通过渗透张力作用裂解的方法，常用于红细胞的裂解3）SDS化学法：A.有机溶剂法：有些有机溶剂（如苯、甲苯等）可以改变细胞壁或膜的通透性，使内含物有选择性的渗透出来。B.表面活性剂：常用的有十二烷基磺酸钠、TritonX-100、去氧胆酸钠等。C.酶解法：

50、必须根据细胞的结构和化学组成选择适当的酶分离方法：1）利用溶解度的差异分离：A.盐析法。B.有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子之间不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。C.温度。2）根据分子量的不同分离：.A.透析和超滤；B.平衡离心法；C.凝胶过滤。3）根据电荷的不同分离：A.电泳；B.离子交换层析。4）亲和层析。分配定律：1）假设有两种互不混溶的溶剂S和M,将A物质溶于一定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂；2）A物质在两相中相互扩散；3）A物质在两相中达到了平衡（在同一时间内，

51、进出两相的A物质的分子数完全相等）时，其分配系数为常数K=CAS/CAM。塔板理论的要点：1）分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为一理论塔相对地化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的；2）没有吸附和电渗作用.通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变化在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好；3）由于纯度高及不溶性，还适合于少量样品的制备，不致污染样品。18塔板制备：1）原料：丙烯酰胺（Acr）和亚甲基双丙烯酰胺（Bis）；2）催化剂：引发剂（过硫酸铵，（NH4）2S2O8）,加速剂（四甲基乙二胺,TEMED；3）化学聚合和光聚合两种；4）凝胶浓度和交联度；5）不连续

52、系统制备。19踏板可能出现的问题及解决措施：1）条带过淡：上样量不足；染色操作错误；2）条带丢失：电泳时间过长，小条带已跑出胶；胶浓度不正确。3）多余条带：还原剂过量。4）条带模糊：被降解;药品不纯。5）条带位置错误：被降解；上样量过大；电泳条件不正确；上样前加热不够；还原剂失效。6）条带不整齐：孔径不均一；胶聚合太快，不均一；可能有气泡；样品离子强度过大。7）条带扩散：电压过低，电泳时间过长；缓冲液离子强度太低；样品本身结构不均一。8）条带弯曲：电泳过程产热过多；染色、固定时间短。9）拖尾：样品溶解不7充分；胶板不干净。蛋白质的浓缩：1）超滤法；2）冷冻干燥法；3）吸收法：聚乙二醇（PEG）

53、、蔗糖、凝胶等；4）沉淀法。五、酵母细胞双杂交1研究蛋白质相互作用的常用方法：1）酵母双杂交；2）亲和层析；3）免疫共沉淀；4）蛋白质交联；5）基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法；6）噬菌体显示系统筛选。2酵母双杂交系统的基本原理：转录激活因子上有DNA结合结构域（BD）与转录激活结构域（AD）;单独的BD虽然能和启动子结合，但不能激活转录;单独的AD也不能激活转录;与调控目的基因有关的两个蛋白质X蛋白与Y蛋白，将X蛋白的编码基因与BD结构域基因融合（表达所得的融合蛋白为”诱饵”蛋白），Y蛋白的编码基因与AD结构域基因融合（表达所得的融合蛋白称为”猎物”蛋白）；如果X蛋白与Y蛋白之间存

54、在相互作用，那么分别位于这两个融合蛋白（”诱饵”蛋白与”猎物”蛋白）上的BD和AD就能重新形成有活性的转录激活因子，从而激活相应基因（报告基因）的转录与表达.通过对报告基因表达产物的检测，反过来可断别作为”诱饵”蛋白与”猎物”蛋白的两个蛋白质之间是否存在相互作用.以酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点：（1）易于转化、便于回收扩增质粒;（2）具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因;（3）酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白相互结合4改造后的酵母细胞的特点：（1）.基因组中GAL4基因是缺失型的；（2）基因组中引入额外的报告基因LEU、TRP、HIS;（3）通过功能互补和显

55、色反应筛选到阳性菌落。5酵母双杂交系统的基本策略：1）表达“诱饵”和“猎物”蛋白；2）检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因做法：首先构建能表达“诱饵”和“猎物”蛋白的表达载体。该载体中可加入进行营养型筛选的基因。6酵母双杂交系统的优点：（1）.高敏感性；（2）.真实性；（3）简洁性；（4）广泛性。（1）.高敏感性。原因：采用高拷贝和强启动子的表达载体，使融合蛋白过量表达；激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物，之后又与启动子结合，此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳定；通过mRNA使信号放大；检测的结果是基因表达产物的累积效应，可检测存在于蛋白质间的微弱或暂时的相互作用。（

56、2）真实性。检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（3）简洁性。融合蛋白相互作用后，减少了制备抗体和纯化蛋白质的繁琐步骤。（4）广泛性。采用不同组织器官细胞类型和分化时期的材料构建cDNA文库，能分析不同亚细胞部位和功能的蛋白质，适用于部分细胞质、细胞核及膜结合蛋白。P7酵母双杂交系统的应用现状：（1）分析已知蛋白之间的相互作用；（2）对蛋白质功能域的分析，如可将待测蛋白质进行点突变或缺失突变再进行双杂交。（3）用已知功能蛋白质筛选双杂交cDNA文库，研究蛋白质之间相互作用的传递途径，发现新基因。（4）分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选

57、文库，再根据筛的已知基因推测新基因功能。（5）绘制蛋白质相互作用系统图谱；（6）在药物设计中的应用。&酵母双杂交系统中常见问题的解决和改进措施：1）假阳性较多；2）转化效率偏低；3）阴性干扰。1）假阳性定义：在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下，报告基因仍被激活。原因：BD融合诱饵蛋白的单独激活作用。这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。如AD融合靶蛋白有DNA的特异性结合，则可单独激活报告基因的表达。AD融合蛋白直接与转录因子相互作用激活报告基因；AD融合靶蛋白与BD相互作用或者AD与BD融合蛋白之间的相互作用，尤其是后者带来许多假阳性。排除假阳性的措施：作严格的对照试验。应对诱饵和

58、靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。采用多个报告基因，且每个报告基因的上游调控区各不相同。目前试剂公司已采用。报告基因整合到染色体上，可使基因表达水平稳定。优化3-AT（3-aminotriazole）浓度。适当增加浓度可减少假阳性。2）转化效率偏低：办法：引进酵母接合型3）阴性干扰：两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。原因：（1）融合蛋白的表达对细胞有毒性时，应选择敏感性较低的菌株或拷贝数低的载体；（2）蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。（3）蛋白在酵母中不能稳定地表达，或者不能正确地折叠，或杂交蛋白不能转入胞核。9酵母双杂交系统局限

59、性：（1）某些诱饵蛋白具有自身激活性质。双杂交前删除该部分，但应避免删除相互作用的结构域；（2）某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。在细胞表面发生的相互作用可采用噬菌体显示系统。（3）双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。（4）有时DNA-BD或AD融合部分不包括相互作用位点，了融合蛋白的正确折叠。（5）哺乳动物蛋白之间相互作用有时要求正确的折叠和翻译后修饰，而酵母细胞不能提供这样的环境。这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。阳性克隆必须进行体外翻译和表达，用抗原表位特异性的抗

60、体进行共定位研究双杂交系统的得到的阳性结果一定要通过其它的实验手段来验证。1O.Gal4为酵母半乳糖苷酶基因gal1的转录激活因子，结构域中的DNA-BD位于N-末端，能识别位于Gal4基因的上游激活序列，AD位于C-8末端。当Gal4的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空间上充分接近，则能恢复Gal4作为转录因子的活性。两个融合蛋白分别构建在穿梭质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。SNF1是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是已知可以相互作用的。当两种穿梭质粒共转化含有Gal4结合位