蛋白酶活性电泳实验

1、蛋白酶活性电泳活性电泳（明胶酶谱法）一、实验原理明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS（含0.1%明胶） 电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝 胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色 条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其 氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡 洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样 缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，

2、而活性电泳又能保证蛋白的活 性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。 通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。二、材料与方法1试剂与溶液配制1.1试剂和仪器：酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考 马斯亮蓝 R250 购自 sigma 公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2.2H2O, Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸， 三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5 X蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白m

3、arker等购自康为世纪公司。水为去离子水 或超纯水。主要仪器:紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等 1.2溶液配制5 X SDS电泳缓冲液配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加 水全约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。 使用时用去离子水稀释至1X，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新 鲜配制的电泳液。明胶储液（10 mg/ml）配法：称取明胶0.1g，加去离子水10 ml，溶解，配好后储存于4C。若凝固成 胶冻状可用温水浴解冻。10 % 过硫酸铵（W/V）

4、配法：称取1g过硫酸铵；加入10ml的去离子水，将固体粉末彻底溶解；贮存于 4C。注意：10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4C保存可使用2周左右，过期会凝胶效果会减弱，1.2.4 凝胶配制：可适当增加用量。1） 10% SDS凝胶之分离胶（含1.0 mg/ml明胶）dH2O3ml30%丙烯酰胺溶液3.3 ml4x分离胶缓冲液2.5 ml10%过硫酸铵0.1 mlTEMED0.004 ml10 mg/ml 明胶1 mlTotal10 ml2） 5%浓缩胶的配置dH2O4.56 ml30%丙烯酰胺溶液1.36 ml4x浓缩胶缓冲液2.0 ml10%过硫酸铵0.1 mlTEMED0.008 m

5、l10 mg/ml 明胶0 mlTotal8 ml3）配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶轻溶液（5%）dH2O7.25 ml30%丙烯酰胺溶液2.50 ml4x分离胶缓冲液3.75ml10%过硫酸铵0.1 mlTEMED0.008 ml10 mg/ml 明胶1.5 mlTotal15 ml4）配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶重溶液15%20%dH2O30%丙烯酰胺溶液1.0 ml 07.50 ml 10.04x分离胶缓冲液3.75ml3.75ml10%过硫酸铵0.1 ml0.1 mlTEMED0.01 ml0.01 ml10 mg/ml 明胶1.5 ml1.5 mlTotal15 ml15 ml重溶液添加蔗糖至

6、0.1g/ml，增加溶液密度。1.2.5洗脱液（1x）配法：量取Triton X-100 25 ml,加去离子水定容至1000 ml即可。1.2.6孵育液（1x）配法：1）中性孵育液：称取 Tris 碱 6.06 g，CaCl22H2O 0.74 g（或 CaCl2 0.555 g），Brij-35 0.2 g，NaCl 11.7 g；加水至 800 ml；用浓 HCl 调 pH 至 7.6；定容至 1000 ml。2）弱酸性孵育液40g NaCH3COOH.3H2O溶于适量水，6mol CH3COOH 168mL， CaCl2.2H2O 0.74 g （或 CaCl2 0.555 g），Br

7、ij-35 0.2 g，NaCl 11.7 g，加水至 800, 用冰乙酸调pH至4.0，定容，1000mL。1.2.7 0.5%（w/v）考马斯亮蓝 R-250（400 ml）配法：称取2 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取100 ml异丙醇加入上 述烧杯中，搅拌溶解；加入40 ml冰醋酸，搅拌均匀；加入260 ml去离子水， 搅拌溶解；用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。1.2.8考马斯亮蓝脱色液（400ml）配法：甲醇：乙酸：水=5： 1： 4。2实验方法2.1蛋白酶样品制备样品液前处理：发酵液10000g离心，上清液经3kD超滤管6500 rpm浓缩，得 到粗酶液，- 20

8、C保存。2.2样品液蛋白酶活性的测定（福林一酚试剂法）2.2.1标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2 mol/L盐酸溶 解，用50mmol/L的Tris-HCl （pH9.0）缓冲液定容至100 mL，分别配成0-100 Mgm/LW不同浓度的溶液。不同浓度酪氨酸溶液各取血匚，加2%酪素l mL，于 50C水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸（TCA） 2 mL,离心，取上清液 l mL,加入 0.4mol/L的碳酸钠5 mL，再加入福林试剂l mL，于37C水浴中显色 15分钟，在680 nm波长比色，测光密度（O.D）。以光密度读数为纵坐标，酪氨 酸的微克数为横

9、坐标，绘制标准曲线。2.2.2样品测定：取适当稀释的酶液l mL,加入2%酪素l mL，以下操作同上， 同时作对照管。2.2.3酶活定义：在50C pH9.0的条件下每分钟水解酪蛋白产生l 酪氨酸的 酶量定义为一个酶活力单位（U）。样品中含蛋白酶活力单位=AxF/15。式中：A为由样品测定的光密度值查曲线得到的相当于酪氨酸的微克数，F为酶 液最终稀释倍数，15为反应时间（分钟）。2.2.4调整样品液的浓度，计算出凝胶电泳所需酶量（约200U），若样品液比活 不够高，须进一步浓缩以提高样品比活，或适当提高加样量。2.3活性胶操作步骤（gelatin zymogram）2.3.1配胶梯度胶配制：灌

10、制梯度胶与线性胶最大的区别在于需要使用梯度生成装置。 高浓度丙烯酰胺溶液内加入蔗糖可以稳定梯度的形成。操作步骤：1）准备好凝胶模具，并装配好梯度混合器，下置磁力搅拌器，混合槽内放入小 转子，调整流速约为5ml/min（可使用蠕动泵）。2）准备好未加TEMED的轻重分离胶溶液，灌制1mm厚的小板胶约需要轻重溶 液各4ml，灌制1mm厚的大板胶约需要轻重溶液各15-18ml，倒入混合器前加入 TEMED并混匀。3）关闭梯度混合器的输出阀和两液槽间的连通阀，在贮液槽中加入定量的凝胶 轻溶液，短暂打开连通阀，让少量轻溶液通过阀门流入混合槽中以除去阀门内气 泡，防止堵塞。4）在混合槽中加入等量凝胶重溶液

11、，完全打开连通阀，开启磁力搅拌器，调整 转速至混合槽内液体稍起漩涡，并固定转速，制相同凝胶使用固定转速以保证制 胶的重复性。5）打开连通阀，输出管头从胶板夹层顶部加入凝胶液体，吸头对着夹层一面， 使液体只沿一块玻璃板留下。当最后轻溶液流入输出管时，要注意，调整流速， 确保最后几毫升轻溶液不致过快流入凝胶夹层影响梯度形成。6）梯度胶顶部用1ml枪缓慢加入少量水，让凝胶聚合约1h充分聚合。7）灌制浓缩胶，准备样品，加样进行电泳。注意：一次可同时跑两板胶，配胶时一板为添加明胶的活性胶，一板为无 明胶的普通胶，配胶过程尽量一致，普通胶做对照。2.3.2上样，样品与非还原性上样缓冲液混合，室温静置10

12、min，不能加热。2.3.3同常规电泳，电泳槽冰浴，电压100-200 V，标记跑至距凝胶底部1-2cm时 结束。2.4活性胶的处理2.4.1直接酶谱法1）活性胶孵育最适pH制备活性胶A 2板（含明胶），浓度梯度为5%-20%，电泳结束后，洗脱，漂洗； 漂洗完毕后，凝胶置于不同pH的孵育液中50C孵育3七考马斯亮蓝R-250染 色山，脱色液脱色过夜。2）活性胶孵育最佳时间制备活性胶A2板（含明胶），电泳洗脱漂洗同上，孵育时将胶条置于已确定的 最适pH孵育液内，分别孵育1h、3h、6h、12h。孵育完毕后操作同上。3）蛋白酶电泳后位置的标定制备活性胶A 1板，B 1板，C1板；电泳洗脱漂洗同上；

13、A胶于最适pH孵育液 孵育最佳时间后染色脱色；B胶浸泡2%酪蛋白溶液2h，孵育同A胶，染色脱色； C胶电泳结束后，切下一条泳道，直接染色脱色，其余不作处理，4摄氏度保存。根据AB胶亮带位置，对比各蛋白酶亮带位置；比较B亮带位置与C胶蛋 白条带进行对比，确定AB胶亮带对应的蛋白酶在C胶中的大概位置。4）将C胶中亮带对应的位置附近几条蛋白条带分别切下，回收。操作见表1。表1活性胶的处理洗脱SDS水漂洗孵育液pH孵育 时间A梯度活性凝胶（明胶）5%-20%振荡洗脱 30minX2 次，20minX2次pH 4.03hpH 7.03hpH 8.53hA梯度活性凝胶（明胶）5%-20%振荡洗脱 30mi

14、nX2 次，20minX2次pH 8.51h3h6h12hA梯度活性凝胶（明胶）5%-20%振荡洗脱 30minX2 次，20minX2次pH 8.53hB梯度凝胶（无明胶）5%-20%振荡洗脱 30minX 2 次20minX2次浸泡2%酪蛋白2h， pH8.5孵育。3hC梯度凝胶（无 明胶）5%-20%直接染色X孵育完毕后，染色1h，过夜脱色。三实验结果与讨论3.1活性胶孵育最适pH由图1看出pH8.5的条件下，凝胶中的酶与底物明胶反应生成的条带数量最多， 亮度最大。图1不同pH孵育条件下明胶活性电泳的差异泳道1、2、3分别为在pH4.0、7.0、8.5条件下孵育3小时的条带3.2活性胶孵

15、育最佳时间由图2得出，在pH8.5条件下，随孵育时间延长条带数增多，孵育4h后，条带 模糊。相比较孵育3h效果最好，条带数最多且条带清晰。图2 pH8.5孵育不同时间下明胶活性电泳的差异泳道1、2、3、4分别为在8.5条件下孵育1h、2 h、3 h、4 h的条带AB图3A：粗酶液非变性SDS结果B：粗酶液非变性SDS复性浸泡酪蛋白孵育结果 3.3讨论从明胶活性电泳结果可以看出，粗酶液中含有多种蛋白酶，但大部分条带 亮度微弱，说明这些蛋白酶含量太低或活性较低。泳道上方有多条亮度较大的条 带，说明该位置可能存在几种活性较高的蛋白酶，且分子量较大，但从粗酶液非 变性SDS结果（图3A）看，对应位置上

16、并无蛋白亮带，复性后浸泡酪蛋 白孵育也无亮带。References:J E.科林根等，精编蛋白质科学实验指南，Dass, S. B. and C. G. Dosoretz, et al. (1995). Extracellular proteases produced by the wood -degrading fungus Phanerochaete chrysosporium under ligninolytic and non-ligninolytic conditions. Archives of microbiology 163 (4): 254-258.Liota, L.A. and W.G. Stetler-Stevenson (1990) Cancer Biology, 1, 96-106Mitsuhashi, W. and A. Oaks (1994). Development of endopeptidase activities in maize (Zea mays L.) endospe