DB15T 2726-2022 牛腹泻疾病防控操作规程

1、ICS65.020.30CCSB 4115内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准DB15/T 27262022牛腹泻疾病防控操作规程Operational procedures for bovine diarrhea prevention and control2022-07-29 发布2022-08-29 实施发 布DB15/T 27262022前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、

2、金宇保灵生物药品有限公司、北京生泰尔科技股份有限公司、内蒙古伊利实业集团股份有限公司。本文件主要起草人：徐晓静、王建龙、谢梦圆、马立峰、郭宇、王炜、魏小军、赵晓军、吴晓亮、韩四娥、王艳杰、周伟光、王秀敏。IDB15/T 27262022DB15/T 27262022Dubos 培养基：杜波斯液体培养基（Dubos medium） E.coli：大肠杆菌（Escherichia coli）HRT-18细胞：人直肠肿瘤-18细胞（Human Rectal Tumor-18 Cell） MA104 细胞：恒河猴肾细胞（Rhesus kidney cell）MDBK细胞：牛肾细胞（Madin Darb

3、y Bovine Kidney Cell）牛腹泻疾病防控操作规程范围本文件规定了牛腹泻疾病的诊断和防治。本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物诊疗机构对牛腹泻疾病的防控。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.4 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验GB 4789.6 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验GB/T 16568 奶牛场卫生规范GB 19489 实验室 生物安全通

4、用要求GB/T 27637 副结核分枝杆菌实时荧光PCR检测方法GB/T 35942 隐孢子虫套式PCR检测方法NY 5047 无公害食品 奶牛饲养兽医防疫准则NY/T 5049 无公害食品 奶牛饲养管理准则3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。牛腹泻疾病 bovine diarrhea牛腹泻是一种以消化不良、腹泻为主要症状的消化道疾病，引起牛腹泻的病因分为传染性和非传染性因素两类，传染性因素包括病毒、细菌、寄生虫等病原体；非传染性因素包括营养、环境、管理等。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。BVDV：牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus）BVD/MD：

5、牛病毒性腹泻/黏膜病（Bovine viral diarrhea-mucosal disease） BRV：牛轮状病毒（Bovine ratovirus）BCoV：牛冠状病毒（Bovine coronavirus）CPE：致细胞病变效应（Cytopathic Effect）1GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫生物安全措施样品采集的生物安全措施符合GB 19489的规定。样品处理的生物安全措施符合GB/T 27401的规定。病因 感染性腹泻引起牛腹泻疾病的主要病原有：病毒性病原包括牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛轮状病毒（BRV） 和牛冠状病毒（BCoV）等；细菌性病原包括致病性

6、大肠杆菌（E.coli）、沙门菌（Salmonella）、副结 核分枝杆菌（ Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis ） 等； 寄生虫性病原包括球虫（Sphaerozoum fuscum）和隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）等。 非感染性腹泻引起非感染性腹泻的主要因素有饲养管理和环境因素，如消化不良、营养缺乏、中毒、应激等。诊断临床诊断流行病学不同年龄和品种牛均可发生，多见于幼龄牛，犊白痢多发于1月龄内犊牛；犊牛副伤寒多发于15 月龄的犊牛；副结核性肠炎多发于成年牛；牛病毒性腹泻病毒多发于618月龄牛，牛轮状病毒和牛冠状病毒

7、多发于1周龄犊牛。病牛和带菌（毒）牛是感染性腹泻的主要传染源。通过消化道、呼吸道、接触、胎盘和交配等途径传播。本病一年四季均可发生，尤以气候多变、寒冷季节和环境卫生较差时多发。临床症状病毒性腹泻牛病毒性腹泻/黏膜病急性感染牛突然发病，体温升至40 42 ，随体温升高，白细胞减少，有的可发生第二次白细胞减少。病牛精神沉郁、厌食，鼻、眼有浆液性分泌物，2 d3 d 内可能有鼻镜及口腔黏膜表面糜烂， 舌面上皮坏死、流涎增多、呼气恶臭，通常在口腔损害之后发生严重腹泻，病初水泻，后带黏液、血液， 甚至脱落的黏膜。部分病牛出现蹄叶炎及趾间皮肤糜烂坏死，导致跛行。慢性病例常出现鼻镜糜烂，眼部常有浆液性分泌物

8、。门齿齿龈通常发红，典型的临床症状是由于蹄叶炎及趾间皮肤糜烂坏死而致的跛行。通常皮肤呈屑状，在髻甲、颈部及耳后最明显。2母牛妊期感染后流产，或产先天性缺陷犊牛，最常见的缺陷是小脑发育不全。牛轮状病毒性腹泻犊牛感染后12 h24 h出现严重腹泻，发病突然，病初表现为精神不振、厌食和腹泻，体温正常或略高，排黄白色稀便，有时带有黏液和血液。病程长者脱水明显，严重者常有死亡。成年牛多呈隐性感染，并在一定时间持续向外界排毒。牛冠状病毒性腹泻犊牛感染后发生腹泻，发病初期出现带血的黄色黏性粪便，后期发展为水泻，有时出现脱水、虚弱、体温低，少数犊牛出现发热、卧地不起等症状，严重的犊牛会出现昏迷甚至死亡。成年牛

9、常突然暴发， 排出深褐色带血稀粪，伴有产奶下降、沉郁及厌食等症状。细菌性腹泻犊白痢病牛初期体温升高达41 42 ，有的犊牛出生后数小时开始腹泻。初期粪便呈粥样、白色或黄白色，后期呈水样、灰白色，混有未消化的凝乳块、血液及泡沫，有酸臭味。末期患病牛伴有腹痛，用蹄踢腹壁。可发生脐炎或关节炎，偶见肺炎。耐过病牛发育迟缓。有时可见神经症状，兴奋不安，有些病例可突然死亡。犊牛副伤寒主要由鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌引起。犊牛多发病突然，病初体温升高至40 41 ，24 h后排出灰黄色稀便，混有黏液和血丝，一般于出现症状后5 d7 d内死亡。病程长者可能会出现腕关节和跗关节肿大。成年牛感染表现高热、昏迷、食欲

10、废绝、呼吸困难，发病后12 h24 h粪便中带有血块，随即腹泻。粪便恶臭，含有纤维素絮片。病牛常死于高热期后。病程长者可见脱水、消瘦、眼窝下陷，黏膜充血发黄。妊牛多流产。副结核性肠炎潜伏期较长，一般多见于25岁成年牛，发病初期为间歇性腹泻，逐渐变为顽固性腹泻，腹泻呈喷射状水样便，排泄物稀薄、恶臭，带有气泡、黏液。体温常无变化，病程长者可见显著消瘦，皮下水肿。寄生虫性腹泻球虫病感染牛精神不振、食欲下降、腹泻，病情加剧时体温升至41 左右，发病后期出现贫血，体温下降至35 36 ，后肢和肛门周围被血粪污染。隐孢子虫病发病后主要表现为腹泻，食欲下降，严重脱水，在腹泻期间的犊牛失去吃乳能力，饮水欲望增

11、加。病理变化病毒性腹泻3DB15/T 27262022DB15/T 27262022牛病毒性腹泻/黏膜病整个口腔可见糜烂灶。典型病变是食管黏膜糜烂斑呈纵行排列。胃黏膜可见出血、糜烂。小肠黏膜肿胀、出血，黏膜脱落甚至形成黏膜管套，肠内容物含有黏液、血液和脱落黏膜，尤以空肠和回肠严重。肠系膜淋巴结肿胀、充血、出血和水肿。牛轮状病毒性腹泻牛轮状病毒感染病理变化主要表现在消化肠道，肠腔内充满凝乳块和乳汁，小肠肠壁变薄、半透明， 肠内容物呈液状、灰黄或灰黑色。牛冠状病毒性腹泻小肠肠壁变薄、透明，肠腔液体增多，严重者引起腹腔积水，胃内有未消化的凝乳块。感染的牛可能伴随呼吸道症状，表现为气管黏膜充血、局限性

12、肺炎等。细菌性腹泻犊白痢剖检可见皱胃和小肠黏膜充血、水肿和出血，皱胃内有大量凝乳块，黏膜表面覆盖胶状黏液。肠内容物常混有血液和气泡，恶臭。肠系膜淋巴结肿大。经脐带感染的病例可见出血性脐炎和出血性脐动脉炎。病程长者伴有浆液纤维素性关节炎和出血性或浆液出血性肺炎。突然死亡的病例常无明显病理变化。犊牛副伤寒剖检可见肠内容物稀薄，混有黏液和血液，呈咖啡色。病程较长时，小肠可见浮膜性与固膜性肠炎， 肠系膜淋巴结呈不同程度的水肿、出血。皱胃黏膜充血、水肿，表面被覆大量黏液，有时可见出血点。脾脏明显肿大而柔软，呈灰红或暗红色，边缘钝圆，被膜紧张，可见出血斑点和粟粒大的坏死灶。肝脏肿大，质地柔软，被膜下散在针

13、尖大的灰黄或灰白色病灶。副结核性肠炎剖检可见尸体极度消瘦，可视黏膜因贫血呈苍白色，被毛粗乱无光。特征性病变为慢性增生性肠炎及相应的淋巴结炎。病变多集中于空肠、回肠和结肠前段。病变肠管变粗，肠腔狭窄，黏膜覆盖一层灰白色黏稠的糊状物。肠黏膜增厚230倍，折叠形成脑回样皱襞。病变部肠管的浆膜淋巴管和相应的肠系膜淋巴管扩张、增粗，呈弯曲的细绳索状，肠系膜淋巴结肿胀。寄生虫性腹泻球虫病以出血性肠炎为特征，消瘦，可视黏膜苍白，小肠后段、盲肠和结肠内充满半凝固的血样内容物， 肠黏膜肿胀、增厚或糜烂性坏死，淋巴滤泡肿大，有白色或灰色小病灶和溃疡，表面有凝乳状薄膜覆盖。直肠内容物呈褐色、恶臭，有纤维素性薄膜和黏

14、膜碎片。肠系膜淋巴结肿大。隐孢子虫病剖检可见腹腔内蓄积大量液体，呈淡黄或微黄色，皱胃黏膜表面存在出血点和出血斑，回肠黏膜存在大面积的出血斑。结果判定4出现7.1.1、7.1.2、7.1.3，可判定为牛腹泻疾病疑似病例。实验室诊断主要仪器设备电镜、低温高速离心机、倒置显微镜、CO2细胞培养箱、恒温细菌培养箱、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪。主要试剂PBS、2%磷钨酸、胰酶、MA104细胞、MDBK细胞、HRT-18细胞、细菌微量生化反应管及指示剂、PCR Taq酶。样品采集粪便样品将棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，放入装有3 mL PBS采样管中；也可无菌采集地上刚排出新鲜粪便。编号并记录相关信息。

15、组织样品取病死牛肠道及内容物、肝、脾、淋巴结等，置于无菌密封袋或采样杯内。样品处理用于病毒检测：对于粪便样品，放入盛有 3 mL PBS 管中，充分振荡， 12000 r/min 4 离心 5 min8 min，取上清备用；对于组织样品，称取 1 g 置于研钵，充分研磨后加 5 mL PBS，混匀， 8000 r/min 4 离心 5 min，取上清备用。将上清于 0.22 m 滤器过滤，-80 冰箱保存或直接接种细胞。用于细菌检测：将粪便样品漩涡震荡，用无菌接种环接种于增菌培养基；组织样品直接取少许加入增菌培养基，于细菌培养箱中 37 培养 18 h24 h。用于寄生虫检测：称取 1 g 粪

16、便于烧杯中，用于形态学检测。病原检测病毒检测电镜检查将采集的粪便或肠内容物用 PBS 制成1:4悬液，于盛有玻璃珠的管内充分震荡30 min，取悬液3000 r/min离心30 min，取上清，15000 r/min离心30 min，取上清，以40000 r/min50000 r/min离心3 h 5 h，弃上清，加12滴蒸馏水悬浮管内沉淀，滴加铜网，2%磷钨酸染色，电镜下观察病毒粒子形态。病毒分离鉴定将处理的样品接种适宜细胞（MA104 细胞、MDBK 细胞、HRT-18 细胞）进行病毒分离培养，根据中和试验（固定血清-稀释病毒法）进行病毒鉴定。PCR 检测5应用普通或荧光定量PCR/RT-

17、PCR方法进行病原核酸检测。采用常继涛文章“牛轮状病毒病原流行病学调查、基因重配毒株的构建及二价减毒株的免疫原性评价”中BRV 引物序列： BRV-VP6-F ： GACGGAGCGACTACATGGT； BRV-VP6-R：GTCCAATTCATACCTGGTGG；采用常继涛等人文章“载牛冠状病毒 N蛋白壳聚糖微球的免疫效果评价”中BcoV引物序列：BCoV-N-F：GCAATCCAGTAGTAGAGCGT； BCoV-N-R： CTTAGTGGCATCCTTGCCAA ； 采用彭雪松论文 “ BVDV 基因分型检测方法的建立及应用” BVDV-F ： TAGCCATGCCCTTAGTAGG

18、AC；BVDV-R：CTCCATGTGCCATGTACAGCA。细菌检测细菌分离将采集的粪便或组织样品，用相应细菌培养基培养。大肠杆菌用伊红美蓝琼脂或麦康凯琼脂培养基培养；沙门菌用SS培养基、HE 琼脂培养基或去氧胆盐钠-枸橼酸盐培养基培养；副结核分枝杆菌初代分离困难，在病变肠段及肠淋巴结分离率较高，可先用4% H2SO4 或 2% NaOH处理，再用Dubods培养基上或HEYM培养基培养。染色镜检将分离纯化的大肠杆菌和沙门菌进行革兰染色，副结核分枝杆菌可用抗酸染色法，显微镜下观察细菌形态。大肠杆菌和沙门菌镜下为粉红色杆菌，副结核分支杆菌镜下可观察到呈单个或分支状排列的红色细长杆菌。将分离纯

19、化的菌用相应的生化鉴定管进行生化特性鉴定，根据伯杰细菌手册统计结果。也可用全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。血清学鉴定致病性大肠杆菌血清学鉴定按照GB 4789.6对致病性大肠杆菌进行血清学鉴定及结果判定。沙门菌血清学鉴定按照GB 4789.4对沙门菌进行血清学鉴定及结果判定。分子检测致病性大肠杆菌 PCR 检测按照GB 4789.6对致病性大肠杆菌进行PCR检测及结果判定。沙门菌 PCR 检测根据沙门菌毒力基因inv A设计引物。参考李文豪论文“呼和浩特牛腹泻部分细菌性病原检测及三重PCR检测方法的建立”中的引物序列：F：CACGCTCTTTCGTCTGGCATTA；R：TAGACAGGGC

20、GGAGGACAAATC。副结核分枝杆菌 PCR 检测按照GB/T 27637对副结核分枝杆菌进行PCR检测及结果判定。7.2.5.3 寄生虫检测6生化鉴定饱和盐水漂浮法配制饱和盐水，称取1 g粪便于烧杯中，加入12 mL29 mL的饱和盐水，饱和盐水于管口形成凸液面，载玻片盖在管口30 min，显微镜下观察球虫卵囊形态并计数。直接涂片染色将粪便涂片，室温滴加10% NaOH 1 min后水洗，采用金胺-酚改良抗酸复染法进行染色镜检。显微镜下观察隐孢子虫卵囊形态。分子检测用特异性引物进行病原的普通或荧光定量 PCR 检测。采用王晓丹论文“牛腹泻部分寄生虫性病原检测方法的建立及应用” 中球虫引物序列： ITS-2-F ： TGAAGAGCTGTGATGGCGTT ， ITS-2-R ： TTCTCTTTTGATTGCGTTGCT； 隐孢子虫参照GB/T 35942进行PCR