水通道蛋白的基本结构与特异性通透机理

1、水通道蛋白的基本结构与特异性通透机理王晶 桑建利（北京师范大学生命科学学院 北京 100875）摘要 水通道蛋白是一个具有跨膜运输水分子功能的蛋白家族。从1988 年Agre 等发现水通道蛋白起，目前在不同物种中已经发现了200 余种水通道蛋白，其中存在哺乳动物体内的有13 种。概述了水通道蛋白的结构、组织特异性分布及特异性通透机理。关键词 水通道蛋白 水分跨膜转运 水分子的跨膜转运对维持不同区域的液体平衡和内环境稳态非常重要。水分子作为一种不带电荷且半径极小的极性分子，很早被证实能通过自由扩散穿透脂质双分子层。在发现水通道蛋白以前，人们一直认为这是水分子透过质膜的唯一方式。但通过实验发现，红

2、细胞和肾小管细胞中水的通透速率之快远非简单扩散强度所能提供的， 因此猜测，质膜上可能存在某种通道介导水的转运。1 水通道蛋白的发现1988年，Agre 等从人类红细胞膜上纯化分离分子量为32106 的Rh 多肽时，偶然鉴定到一种新的分子量为28106 的整合膜蛋白， 并且通过免疫印迹发现这类蛋白也存在于肾脏的近端肾小管中1，把它称为类通道整合膜蛋白（channel-like integralmembrane protein, CHIP28）。随后，在1991 年Agre和Preston 成功克隆得到了CHIP28 的cDNA，通过分析其编码的氨基酸序列，发现CHIP28 含有6个跨膜区域、2个

3、N-糖基化位点、且N 端和C 端都位于膜的胞质一侧。另外，对比CHIP28 与早期从牛晶体纤维中克隆得到的主要内源性蛋白（major intrinsicprotein,MIP）的DNA 序列，发现二者具有高度同源性。由于很早以前就证实了MIP 家族的成员蛋白参与形成允许水和其他小分子通透的膜通道，因此，推测CHIP28 可能也具有类似功能2。1992 年，Preston 等通过在非洲爪蟾的卵母细胞中表达CHIP28， 首次证实它是一种水通道蛋白。非洲爪蟾的卵母细胞对水具有极低的渗透性，当向其中显微注射体外转录的CHIP28 的RNA后，卵母细胞在低渗溶液中迅速膨胀，并于5 min内破裂。这一现

4、象表明注射CHIP28 的RNA 后卵母细胞膜的水通透性有了明显提高。为了进一步确定CHIP28 的功能，将提纯的CHIP28 构建在蛋白磷脂体中， 构建后的蛋白磷脂体对水的通透性增长了50 倍，但对尿素却不具备通透性3。这些结果最终证实了CHIP28 为水通道蛋白， 后来它被命名为水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP1）。水通道蛋白的发现，开辟了一个崭新的领域。随着更多亚型的发现， 水通道蛋白相关研究成为了膜转运方向的研究热点，Agre 也因其对水通道蛋白做出的突出贡献而获得2003 年诺贝尔化学奖。2 水通道蛋白的分子结构水通道蛋白分布广泛，目前已在哺乳动物、两栖类、植物、酵母、

5、细菌以及各种各样的有机体中发现水通道蛋白的存在。水通道蛋白是一类高度保守的疏水小分子膜整合蛋白， 各种亚型之间蛋白序列及三维结构非常相似。哺乳动物水通道蛋白的分子大小在2610634106 之间， 氨基酸序列同源性为19%52%4。因水通道蛋白的三维结构相似，一般以AQP1的结构作为代表。AQP1 是一条由269 个氨基酸残基构成的单肽链，对比AQP1 分子前后半段的氨基酸序列，发现2 段序列具有相关性，推测AQP1在进化上可能是通过基因复制而来。单肽链在细胞膜上往返折叠形成6 个 螺旋的跨膜区域， 并且肽链的N 端和C 端都位于质膜内侧；6 个跨膜区域由5 条环（AE loop）相连。目前，

6、被人们广为接受的水通道蛋白三维结构是“ 沙漏模型（hourglassmodel）”4，模型指出：肽链中的B 环和E 环具有高度保守的天冬酰胺- 脯氨酸- 丙氨酸（Asn -Pro -Ala，NPA）特征性序列，B 环和E 环折返进入膜双分子层，2个保守的NPA 序列在膜的磷脂双层中间位置相互结合，6 条跨膜区域在四周包围， 共同构成了一个供水分子通过的亲水通道（图1）。通过对AQP1 的三维结构进一步研究发现，B环和E 环折返入膜后分别形成短螺旋B（HB）和短螺旋E（HE），中心孔道处起稳定作用的2 条NPA基序几乎呈90交叉，所形成的亲水通道的直径约为2.81010 m，刚好能容纳单个水分子

7、通过，外围6 条跨膜区域呈现右手螺旋包围。构成中心孔道表面的除B 环和E 环外，还有螺旋2、5 以及螺旋1、4 的C 端部分。有研究指出，将B 环和E 环联系在一起的作用力主要是2 条NPA 基序中脯氨酸残基间的范德华力，同时也受到离子键和氢键的稳定。几乎所有AQP 分子的B 环和E 环上都有高度保守的NPA 特征性序列。但也有少数例外： 在AQP11 和AQP12 中仅发现E 环上具有NPA 序列，另一个在B 环上的NPA 序列分别由天冬酰胺-脯氨酸-半胱氨酸（Asn-Pro-Cys,NPC）和天冬酰胺-脯氨酸-苏氨酸（Asn-Pro-Thr,NPT）替代6。在体内，AQP1 主要以同源四聚

8、体的形式存在。研究发现，四聚体中某个水通道蛋白单体发生突变并不会影响其他3 个蛋白单体的功能，即每一个水通道蛋白单体是一个独立的功能单位。水分子的跨膜渗透是通过水通道蛋白单体的中心通道完成的，而无法通过中聚体的中央孔洞（4 个单体衔接处的中心缝隙）7。每个单体通过跨膜的 螺旋与邻近的2 个单体相互作用。这些相互作用很有可能受到一些氨基酸残基之间的氢键的稳固。3 水通道蛋白的种类迄今为止，已有200 余种水通道蛋白在不同物种中被发现， 其中存在于哺乳动物体内的水通道亚型有13 种，即AQP0-AQP12（见下表）。根据它们的基因结构和通透性，这13 种水通道蛋白可划分为3 组： 传统水通道蛋白（

9、orthodox aquaporins）（ 包括AQP0、1、2、4、5、6、10）、甘油水通道蛋白（aquaglyceroporins）（ 包括AQP3、7、9） 和未明确分类的AQP8、11、12。目前对哺乳动物中较早发现的10 个水通道蛋白AQP0AQP9 研究较为透彻， 它们的功能也通过人类疾病的鉴定及对基因缺失小鼠的研究而被鉴定； 而较近发现的3 个成员AQP10AQP12 则相对研究较少，它们的胞内定位及表达异常导致的人类疾病都还未被鉴定8。4 水分子特异性通透机理水通道蛋白对水分子具有高度选择性。大部分水通道蛋白严格排斥除水分子以外的所有物质通过， 包括结合水分子的氢离子（ 水合

10、氢离子，H3O+）、甘油和各种离子等，但也有部分水通道蛋白对甘油等小分子中性溶质具有通透性。AQP1膜蛋白的密度可达到大于109 个/m2，。这一密度远远高于普遍的离子通道的密度（除突触后膜上的乙酰胆碱受体外，大多小于1 个/m2）。水通道蛋白是怎样对水分子进行严格筛选的呢？ 首先，通道的空间大小只能容纳单个水分子，限制了比水分子大的分子通过。以对水分子具有专一通透性的AQP1 为例，AQP1 的中心通道呈哑铃状，狭口处在脂双层中央B 环和E 环相互作用的NPA 序列位置附近。构成中心孔道表面的氨基酸残基中，亲水和疏水的残基数量基本是对等的。这些亲水残基在对水分子去水化过程中有重要作用。另外，

11、中心孔道最窄处由4 个残基构成，包括亲水的His180、Arg195、Cys189 和疏水的Phe56。虽然这一缩口只有1 个氨基酸残基的跨度， 但是它2.81010 m 的直径仍然阻断了比水分子大的离子和溶质的通过。因此，这4 个残基的变化都可以对水通道的选择性产生影响。根据已有研究可知，His180 在只对水具有通透性的水通道蛋白中高度保守， 但在一些对甘油也具通透性的水通道蛋白，如GlpF 中则被甘氨酸残基代替11。另一个困扰人们已久的问题是何种机制阻断了水道蛋白对质子的跨膜运输。早在短杆菌肽中的研究就已表明， 水可以以连续不断的方式通过膜上的开放孔,这种水分子排列成一条直线、质子由一个

12、水分子传递到另一个水分子、并伴随着氢键的断裂和重建的过程，被研究者称为“Grotthus 效应”。既然水通道蛋白对水具有特异通透性, 那么可通过“Grotthus效应”传递的质子运输又是怎样被阻断的呢？目前被较多人接受的另一个机制是在NPA 序列处有1对偶极子对水分子起着定向作用。在每个水通道的中心位置，NPA 序列上的Asn76 和Asn192 的氨基向孔道最窄处延伸。此时，位于此处的水分子与其邻近的水分子之间的氢键发生断裂，其氧原子替代性地与Asn76 和Asn192 的氨基形成氢键。这一变化重排了水的分子轨道，使最窄处水分子的2 个氢原子定向到与通道轴线垂直的方向（图2）。因此，中心处水

13、分子的2 个氢原子无法与周围邻近的水分子形成氢键；另外，在通道最窄处的残基附近的氨基酸残基都是疏水的，因此不会有另外的残基与水分子的2 个氢原子形成氢键。这一模式使得位于通道上下2 部分中的水分子在取向上相反，不利于形成氢键链，从而也阻断了质子通过“Grotthus 效应”完成连续传输，同时，因为疏水氨基酸不参与形成氢键，也保证了水分子在通过孔道时只需要跨越一个相当低的能量障碍7，12。a：NPA 基序上的偶极矩改变了中心水分子的定向， 使通道上下水分子取向相反。b，c：水分子与Asn192、Asn76 的氨基形成氢键，水分子的2 个氢原子重定向至与通道轴线垂直7据已有研究， 水通道蛋白几乎严

14、格排斥其他所有离子。从理论上来说， 水合化的离子直径为7.161010 m，而去水合化的离子只有1.91010 m的直径，是可以通过最窄处为2.81010 m 的中心通道的。孔道狭窄的阳离子通道就具有使离子去水合化的能力， 如KcsA 钾通道中就有16 个羰基氧以4 个每环的结构垛叠排列， 这一结构具有分离与离子水合的水分子的能力。而AQP1 中孔道中的羰基氧的结构虽然足以分离体相水中的水分子，但是只能使水合离子部分去水合化，而后者则因直径仍大于狭口直径而无法通过水通道13。主要参考文献1 Denker B.M.， Smith B.L.， Kuhajda F.P. et al . Identification，purification， and partial characterization of a novel Mr 28000integral membrane protein from erythrocytes and renal tubulesJ Biol Chem，1988，263(3):15634.2 Preston G. M.， Agre P. Isolation of the cDNA for erythrocyteintegral membrane protein of 28 kilodaltons:member of an ancient