免疫共沉淀原理及注意事项

1、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)单系金-实验原理以（抗体和抗原）之间的专一性作用为基万船勺用于研究（蛋白质相互作用）的经典方法。是确定两种蛋白质在完整（细胞内生理性）相互作用的有效方法。抗休红细胞抗体是兌疫系统A外界抗贩的剌激F产生的科蛋白如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合药蛋白頂Y也能沉淀下乗。Y-X-抗X问题：细胞怎样保持生理状态-不变性？裤/VDAJVLCO-IP应用与IP区别测定两种目标蛋白质是否在体内结合确定一种特定蛋白质的新的作用搭档co-ip与ip只取决于检测焦点是初级靶分子（抗原）还是次级靶分子（相互作用蛋白）1.提取蛋白2

2、在细胞裂解液中加入抗X的抗体3孵育后再加入ProteinA或G(于Agarosebead_t)若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成复合物:YX抗X抗体ProteinA或Gn3经变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。(xy抗原、x抗体)agarosebead琼月旨糖珠proteinA/G有一个很重要的特性就是能与抗体的Fc段结合COJP原理图解细胞亵解物或蛋白混合極和偶联有抗纯的脏一起斬有J偶联的抗体亠抗廊离心井诜涤j7丁r洗脫3诃与紬:區反应的蛋白proteinA/G-琼脂糖珠复合物ProteinA是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体（主要是IgG）的F

3、c区结合。目前多用proteinA/G预先结合在argarosebeads上。ProtelnA/G的作用及具体原理“捕获”抗体，形成复合物,抗体-目的蛋白-ProteinA/Gbeads非共价健结合ProteinA/G-garosebeads加样缓冲液-煮沸变性-离心共价结合ProteinA/GbeadsEP管（抗体-目的蛋白-少量非特异性吸附蛋门）。二COIP特征优点(1相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态(2蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响(3可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物二COJP特征局限性(1可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质一蛋白质相互作用

4、(2两种蛋白质的结合可能不是直接结合，有第三者在中间起桥梁作用;(3必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体，若预测不正确，实验就得不到结提取细胞总蛋白11离心/上清电泳（抗原抗体）三实验流程准备PA珠子，PBS洗3遍IPA珠子加入蛋白裂解液（去除非特异性蛋白背景）I离心去PA珠子,取上清I测蛋白浓度（BCA法）I加一抗反应（4C过夜）I加PA珠子捕捉复合物（室温lh或代过夜）离心，收集沉淀，预;令RIPABuffer洗3遍I上样缓冲液悬浮沉淀,加热游离抗原.抗体.珠子四实验结果分析SDSWesternblotting分析:质谱分析检测目的蛋白SDS结果分析(a)(b)Myosin

5、0-GalactosidaseGlycogenphosphorylasebBovineserumalbuminOvalbuminCarbonicanhydraseSoybeantrypsininhibitorLysozyme12标难曲线只对同相对迁移率=蛋白样品距加样端迁移距离5）漠酚蓝区带中心距加样端距离（cm）以每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁移率即可汎J出其分于量。一块凝月交上的样品的分子量测定才具有可靠性。WB结果分析ECL试剂SUBSTRATE二抗（辣根酶标记的羊抗兔igG）转印膜上蛋白检测示意图COIP与质谱分析流程肽质谱指纹图酶解上样与洗涤

6、色谱垃料洗脱W丿出冑径（1H）流出液（5001000nl）钠升级电喷雾离了化毛细管数据库蛋白质鉴定注释三实验的关键1-实验最需要注意点就是抗体的性质。特别是多抗的特异性是问题。2.为防止蛋白的分解、修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂，低温下进行实验。3.考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释。4.确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。？注意的问题：1裂解液III细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细谕内存在的所有蛋白质一蛋白质相互作用，

7、多采用非离子变性剂（NP40或TritonX-100）。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2%SDS）,细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktaileroRIPA裂解液普利莱基因技术有限公司100mlRIPABuffer：50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40,0.1%SDS.(100元)说明：1裂解液临用前可新鲜加入最终浓度为lmM的PMSF或其它蛋白酶抑制剂。2.RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法但可用BCA法或改良Lowry法测定蛋白浓度裂解液成分国内博士：细胞裂解液：

8、50mMTris-HC（lpH7.5）,150mMNaCl,0.5%NP-40,lmMEDTA使用前加入PMSF至终浓度ImM、proteinaseinhibitorcockta订（混合物）。刘岩BC300buffer20mMTris-Cl,pH8.0,300mMNaCl,0.2mMEDTA,10%glycerol（甘油）,0.2mMPMSF,0.2%Tween2021免疫沉淀中抗体的选择參克隆抗体单克隆坑体单克隆抗体群（由f免痕原产生的勢个单克隆抗体混合物）抗体抗原作用扱佳亡抗依的肖口力决走（殽隹或者取弱）极佳11常很妊隹有时会有三三持驴性用互作走視哇，彳巨有时会有乂叉反应极佳（曰=淸可处行

9、IP且浸有交叉反应的抗沫组如克崖抗碎）优点亲和力言（主于抗恬可以与目的蚩二的家个抗原决走簇吋互作屋特异性F.三可麻琨量供应持异性好.亲力高（曰三选挂可涯亡IF耳殳每交叉註的抗雄且成呈亮隆抗擄）缺忌三三样冥性唔互作定艰進去除幕要隽送寺口力盲的抗烧：:抗底表泣可館会枝相互诈冃呈=能竣篇选得到迫符合条件世呈売隆井穴妄所以里克圄亢体牡就7落易歸鬼疫沉淀效果极僅（由于亲mtl高）主抗龙:的奇口力决走（换哇或君更弱）板佳（曰丁选拦可心迭&尸巨妥有交叉反应昴抗曲且衣羊売隆抗沐竽）免疫共沉淀效果遷常很妊.址有时2持貝炷弓互作至会芾来假阳性主抗馆:的奇口力决走和抗底表垃是吞戎相互诈巨蛋e适蔽决走（换哇或看极弱）

10、极佳曰=粋可以耘送行IF巨浸有却艮应旳抗体迫舞芫隆抗碎）渎色浅免疫药7果逵常很好佢有时三三持驴性月互作弔会带来假阳性主抗徒的茅口力决二和抗原表忙层召氓遠菽或君以及彳亢辰表位是舌乐交联实趁所藪环决走（菽隹或着氐弱）极佳（曰亍选擇可哄磁送疔尸巨没有交叉艮应笔抗沌组咸笛芫隆扔碎）注意的问题：22抗体使用对照抗体：（阴性和阳性）阴性：单克隆抗体：同一种属的IgG兔多克隆抗体：正常兔IgG阳性：细胞内某种蛋白的抗体（做膜蛋白A,用膜蛋白B）未检测到目得蛋白或蛋白很少可能原因处理方法1样品被蛋白酶降解：添加蛋白酶抑制剂；所有操作保持4弋以下冰上操作并防止冻融2抗体浓度太低:调整抗体浓度，必要时设立浓度梯度，摸索最佳浓度3抗抗体亲合力太低:选用适合于IP和/或IB的相应抗体4.IP抗体未与agarose珠子结合：选用适合于IP的相应珠子,正确保存防止变质或干燥5.Tag未罪露在融合蛋白构象的表面：改变tag融合表达部位6裂解液严谨度太高:改用低严谨度裂解液目得蛋白高背景:可能原因处理方法非特异蛋白结合在无血清培养液中裂解细胞；在免疫沉淀前用protein（G/A）珠子预洗，免疫沉淀后增加漂洗次数和严谨度（高盐或去垢剂）裂解液严谨度太低改用高严谨度裂解液实验仪器或液体被污染转移膜上的非