细胞生物学实验

1、. 细胞生物学教案 邵邻相 PAGE ：.；PAGE 9第五章 物质的跨膜运输与 信号传送一教学目的：1深化了解被动运输、自动运输和内吞外排的概念，以及物质跨膜运输的重要意义；2 了解细胞信号传送的主要特点，掌握甾类激素信号通路、cAMP信号通路、磷脂酰肌醇信号通路和EGF受体信号通路的主要环节。二重点：跨膜运输的方式和细胞通讯的信号通路。三难点：跨膜运输的机制。四授课方式与教学方法：讲授、讨论、多媒体辅助教学。五教学内容: 细胞膜是细胞与细胞外环境之间的一种选择性通透屏障，物质的跨膜运输对细胞的生存和生长至关重要。多细胞生物是一个忙碌而有序的细胞社会，这种社会性的维持不仅依赖于细胞的物质代谢

2、与能量代谢，还有赖于细胞通讯与信号传送，以协调细胞的行为。物质的跨膜运输一.被动运输passive transport定义：经过简单分散或协助分散实现物质由高浓度向低浓度方向的跨膜转运。转运的动力物质的浓度梯度，不需求细胞提供能量。类型：简单分散simple diffusion、协助分散facilitated diffusion膜转运蛋白：1.载体蛋白carrier proteins通透酶permease性质；介导被动运输与自动运输。2.通道蛋白 channel proteins 具有离子选择性，转运速率高； 离子通道是门控的；只介导被动运输 膜转运蛋白 通道蛋白(被动运输)膜转运蛋白 载体蛋

3、白 单运输 (被动运输+自动运输) 共运输协同运输 对向运输细胞膜上的运输蛋白： 载体蛋白：经过构象变化运输物质 通道蛋白：构成通道、运输物质载体蛋白:膜上一类转运蛋白，可特异的、可逆的与某物质结合，经过构象变化将物质从膜的一侧运到另一侧。 又称通透酶，与运输物质的结合与酶的动力学类似。 通道蛋白:构成亲水的通道，允许一定大小和一定电荷的离子经过。因运转的几乎都是离子，又称离子通道.通道蛋白构成通道：继续开放如水通道延续开放闸门通道配体闸门通道：配体与受体结合，通道开放。电压闸门通道：膜电位变化，启动通道开放。压力激活通道：压力变化,启动通道开放。离子闸门通道：特定离子浓度变化，启动通道。神经

4、肌肉兴奋，不到秒钟的时间内完成，这一过程包括四种通道依次例如：神经肌肉兴奋，不到秒钟的时间内完成，这一过程包括四种通道依次开放：A、刺激神经激动神经末梢，膜去极化，电压闸门通道钙离子通道开放，钙离子进入神经末梢，刺激乙酰胆碱ACH分泌到突触间隙中；B、ACH与突触后肌细胞膜上的受体结合，配体闸门钠离子通道开放，钠离子进入肌细胞，肌细胞膜去极化；C、肌细胞膜上电压闸门钠离子通道开放，更多的钠离子进入肌细胞，肌细胞膜进一步去极化，产生动作电位，分散到肌细胞膜；D、肌浆网上的离子闸门通道钙离子通道开放，钙离子进入细胞质，引起肌肉收缩。二.自动运输active transport定义：是由载体蛋白所介

5、导的物质逆浓度梯度或电化学梯度由浓度低的一侧向浓度高的一侧进展跨膜转运的方式。细胞耗能。由ATP直接提供能量和间接提供能量及光能驱动.被动与自动运输的比较 自动运输类型：三种根本类型由ATP直接提供能量的自动运输钠钾泵 钙泵Ca2+-ATP酶质子泵：P-型质子泵、V-型质子泵、H+-ATP酶协同运输cotransport由Na+-K+泵或H+-泵与载体蛋白协同作用，靠间接耗费ATP所完成的自动运输方式物质的跨膜转运与膜电位进展自动运输的物质：各种离子如钠离子、钾离子、氯离子、碳酸根离子、钙离子等。葡萄糖、氨基酸等带电荷极性分子。进展自动运输的载体又称“离子泵钠钾泵膜上运输钠和钾离子的载体称“钠

6、钾泵或“钠钾ATP酶。钠钾泵的组成：大亚基100000DN：外侧：1、钾结合位点；2、鸟苯苷结合位点内侧：1、钠结合点；2、ATP结合点小亚基45000DN：与大亚基结合，作用不明。“钠钾泵的自动运输机制即：3Na+结合到结合位点上 酶磷酸化 酶构象变化 3 Na+释放到细胞外 2K+结合到位点上 酶去磷酸化 2K+释放到细胞内，酶构象恢复原始形状。Na+-K+泵的作用产生和维持膜电位；为葡萄糖、氨基酸的自动运输发明条件；维持细胞的浸透压，例如：当肾小管细胞间隙钠过高时会导致细胞内水分外渗，细胞内缺水，人会感到口渴而饮水多。钙泵 ,又称Ca2+-ATP酶位于质膜和内质网上的跨膜蛋白,将Ca2+

7、输出细胞或泵入内质网腔中储存,以维持细胞内低浓度的游离Ca2+.钙泵任务与ATP的水解相偶联,每耗费一个ATP分子转运两个Ca2+ .钙调蛋白是钙泵的激活因子. 钙调蛋白(CaM)是Ca2+应对蛋白,由148个氨基酸残基组成,含4个构造域,每个构造域可以与一个Ca2+. CaM本身无活性, Ca2+与CaM结合后构成Ca2+ - CaM复合体,再与靶酶结合将其活化. 质子泵,又称H+-ATP酶位于植物细胞、真菌和细菌质膜上的跨膜蛋白,将H+泵出细胞建立跨膜的H+电化学梯度，驱动转运溶质进入细胞。P-型质子泵：位于真核细胞的质膜上，转运H+过程中涉及磷酸化和去磷酸化。V-型质子泵：位于动物细胞溶

8、酶体膜和植物液泡膜上，转运H+过程中不涉及磷酸化的中间体。提高细胞质中的pH和细胞器内的酸度。 HYPERLINK F:ATP_SynthesisATP的合成.mov t _parent H HYPERLINK F:ATP_SynthesisATP的合成.mov t _parent + HYPERLINK F:ATP_SynthesisATP的合成.mov t _parent -ATP HYPERLINK F:ATP_SynthesisATP的合成.mov t _parent 酶：位于线粒体的内膜，植物类囊体膜和细菌质膜上，利用 HYPERLINK F:Electron_Transport%2

9、0呼吸链中电子的运输.mov t _parent 膜上 HYPERLINK F:Electron_Transport%20呼吸链中电子的运输.mov t _parent H HYPERLINK F:Electron_Transport%20呼吸链中电子的运输.mov t _parent + HYPERLINK F:Electron_Transport%20呼吸链中电子的运输.mov t _parent 梯度合成ATP。协同运输cotransport由Na+-K+泵或H+-泵与载体蛋白协同作用， 靠间接耗费ATP所完成的自动运输方式 自动运输的能量不是由ATP直接提供，而是由储存在膜上离子梯度中

10、的能量来驱动的。这类运输进展时，一种物质的运输必需依赖另一种物质的同时运输，故称为协同运输。协同运输两种物质同时相向转运，称对向运输逆向协同运输。如Na+-K+；Na+H+；Cl-HCl3-两种物质同时同向转运，称共运输同向协同运输。如Na+-G；Na+-aa浓度差+电位差电化学梯度动物细胞中，Na+的电化学梯度通常是驱动另一种分子主运输的能量，如Na+ 梯度驱动G、aa的自动运输三、胞吞作用endocytosis与胞吐作用exocytosis作用：完成大分子与颗粒性物质的跨膜运输，又称膜泡运输或批量运输bulk transport。属于自动运输。胞吞作用胞吐作用胞吞作用胞饮作用pinocyt

11、osis与吞噬作用phagocytosis。胞饮作用与吞噬作用主要有三点区别特征内吞泡的大小转运方式内吞泡构成机制胞饮作用小于150nm延续发生的过程需求笼形蛋白构成包被及接合素蛋白衔接吞噬作用大于250nm需受体介导的信号触发过程需求微丝及结合蛋白的参与受体介导的内吞作用及包被的组装包内体及其分选作用胞内体：是动物细胞内由膜包围的细胞器，其作用是传输由胞吞作用新摄入的物质到溶酶体被降解。胞内体上有质子泵。胞吐作用胞吐作用：是将细胞内的分泌泡或其他某些膜泡中的物质经过细胞膜运出细胞的过程。组成型的外排途径constitutive exocytosis pathway一切真核细胞延续分泌过程用于

12、质膜更新膜脂、膜蛋白、胞外基质组分、营养或信号分子default pathway：除某些有特殊标志的駐留蛋白和调理型分泌泡外，其他蛋白的转运途径：粗面内质网高尔基体分泌泡细胞外表 调理型外排途径regulated exocytosis pathway特化的分泌细胞储存刺激释放产生的分泌物如激素、粘液或消化酶具有共同的分选机制，分选信号存在于蛋白本身，分选主要由高尔基体TGN上的受体类蛋白来决议 膜流：动态过程对质膜更新和维持细胞的生存与生长是必要的囊泡与靶膜的识别与交融胞吞作用途径 膜上糖蛋白或糖脂识别 与膜接触 膜内陷包围物质膜交融去封口 囊泡 进入细胞胞内体：是动物细胞内由膜包围的细胞器，

13、其作用是传输由胞吞作用新摄入的物质到溶酶体被降解。胞内体上有质子泵。第二节 细胞通讯与信号传送一、细胞通讯与细胞识别 一细胞通讯cell communication一个细胞发出的信息经过介质传送到另一个细胞产生相应的反响。细胞间的通讯对于多细胞生物体的发生和组织的构建，协调细胞的功能，控制细胞的生长、分裂、分化和凋亡是必需的。细胞通讯方式：分泌化学信号进展通讯 内分泌endocrine激素分泌后作用较远的靶细胞，其传送介质为血液。旁分泌paracrine激素分泌释放后作用于临近的靶细胞，其传送介质为细胞间液。自分泌autocrine激素分泌释放后仍作用于本身细胞，其传送介质为胞液；化学突触ch

14、emical synapse接触性依赖的通讯细胞间直接接触，信号分子与受体都是细胞的跨膜蛋白间隙衔接实现代谢偶联或电偶联二细胞识别cell recognition 概念：细胞经过其外表的受体与胞外信号物质分子配体选择性地相互作用，进而导致胞内一系列生理生化变化，最终表现为细胞整体的生物学效应的过程。 信号通路signaling pathway细胞识别是经过各种不同的信号通路实现的。细胞接受外界信号，经过一整套特定的机制，将胞外信号转导为胞内信号，最终调理特定基因的表达，引起细胞的应对反响，这种反响系列称之为细胞信号通路。三细胞的信号分子与受体信号分子signal molecule亲脂性信号分子

15、亲水性信号分子气体性信号分子(NO) 受体receptor受体是细胞膜或细胞内的功能性糖蛋白，可特异地识别配体并与之结合，引起相应的生物效应。多为糖蛋白细胞内受体：为胞外亲脂性信号分子所激活激素激活的基因调控蛋白胞内受体超家族此型受体主要包括类固醇激素受体，如糖皮质激素受体GR、雌激素受体ER、孕激素受体PR、雄激素受体AR、盐皮质激素受体MR等； 维生素D3受体VDR以及甲状腺激素受体TR。 这些激素进入细胞以后，能与特异性受体结合构成活性复合物，然后作用于染色体DNA，调理基因表达，从而影响细胞的物质代谢和生理活动。 细胞外表受体:为胞外亲水性信号分子所激活 细胞外表受体分属三大家族： 离

16、子通道偶联的受体ion-channel-linked receptorG-蛋白偶联的受体G-protein-linked receptor酶偶连的受体enzyme-linked receptor受体的功能：介导物质跨膜运输(受体介导的内吞作用)信号转导：受体的激活activation级联反响；受体失敏desensitization封锁反响、减量调理down-regulation降低反响。第二信使second messengercAMP、cGMP、三磷酸肌醇IP3，二酰基甘油DG分子开关molecular switches细胞内信号传送中起举足轻重作用的一类蛋白质，经过磷酸化或结合GTP而活化，

17、开启信号通路，经过去磷酸化或结合GDP而失活，封锁信号经过。二、经过细胞内受体介导的信号传送亲脂性的小分子经过与细胞内受体结合传送信号。细胞内受体本质是激素激活的基因调控蛋白，构成细胞内受体家族。甾类激素介导的信号通路 两步反响阶段： 初级反响阶段：直接活化少数特殊基因转录的，发生迅速；次级反响：初级反响产物再活化其它基因产生延迟的放大作用。 一氧化氮介导的信号通路三、经过细胞外表受体介导的信号跨膜传送亲水性的化学信号分子普通不能直接进入细胞，而是经过与细胞外表特异受体的结合，进展信号传导，进而对靶细胞产生效应。根据信号转导机制和受体蛋白类型的不同，细胞外表受体分为三大家族：一离子通道偶联的受

18、体介导的信号跨膜传送受体本身为离子通道，信号神经递质与受体识别结合，开闭通道，离子流动，改动细胞膜的兴奋性。特点：受体/离子通道复合体，四次/六次跨膜蛋白跨膜信号转导无需中间步骤主要存在于神经细胞或其他可兴奋细胞间的突触信号传送有选择性：配体的特异性选择和运输离子的选择性G-蛋白偶联的受体介导的信号跨膜传送由G蛋白介导,将信息传送给第二信使,引起一系列胞内生物效应。G蛋白：鸟苷酸结合蛋白的总称，其共同特征是： 由gba三个亚单位组成；位于细胞膜受体与效应器之间的转导蛋白；具有结合GDP或GTP的才干，有GTP酶活性；可激活效应蛋白，实现信息转导功能。cAMP信号通路 磷脂酰肌醇信号G-蛋白偶联

19、受体又称蛇型受体。此型受体通常由单一的多肽链或均一的亚基组成，其肽链可分为细胞外区、跨膜区、细胞内区三个区。跨膜区由7个螺旋构造组成；多肽链的N-端位于细胞外区，而C-端位于细胞内区；在第五及第六跨膜螺旋构造之间的细胞内环部分第三内环区，是与G蛋白偶联的区域。 大多数常见的神经递质受体和激素受体是属于G蛋白偶联型受体。 细胞外表其它与酶偶联的受体本身是酶，具有TPK活性，主要是一些生长因子的受体，与配体结合即活化，使靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化，引起细胞反响。通常与酶衔接的细胞外表受体又称催化性受体，目前知的这类受体都是跨膜蛋白，当胞外配基与受体结合即激活受体胞内段的酶活性。至少包括5类：受体酪氨

20、酸激酶 受体蛋白酪氨酸残基自磷酸化。受体丝氨酸/苏氨酸激酶HYPERLINK TGFb_Signaling 肿瘤坏死因子Beta作用途径.mov如TGF的作用受体酪氨酸磷酸酯酶受体蛋白酪氨酸残基去磷酸化受体鸟苷酸环化酶ANPs-signals合成cGMP酪氨酸蛋白激酶联络的受体 cAMP信号通路反响链：激素G-蛋白偶联受体G-蛋白腺苷酸环化酶cAMP cAMP依赖的蛋白激酶A基因调控蛋白基因转录 组分及其分析 G-蛋白偶联受体 G-蛋白活化与调理G蛋白的效应蛋白酶主要有腺苷酸环化酶AC和磷脂酶CPLC。前者可催化第二信使cAMP的产生，后者可催化第二信使DG和IP3的产生，从而将配体的信号传送

21、到细胞内。 1、CAMP信号途径信号与受体结合，受体活化，构象改动，暴露与G蛋白的结合部位。配体受体复合物与G蛋白结合，G活化，Gs构象改动，结合GTPGs-GTP复合物与分别，暴露与AC的结合部位。Gs-GTP与 AC结合，AC活化，分解ATP为CAMPGs分解GTP为 GDP，构型改动，与 AC分别，AC失活，Gs与结合，恢复静息形状。 GPLR的失敏：例：肾上腺素受体被激活后，10-15秒cAMP骤增，然后在不到1min内反响速降，以致消逝。受体活性快速丧失速发相失敏desensitization；机制：受体磷酸化 受体与Gs解偶联，cAMP反响停顿并被PDE降解。两种Ser/Thr磷酸

22、化激酶： PKA 和肾上腺素受体激酶 ARK， 担任受体磷酸化；胞内协作因子扑获蛋白 arrestin结合磷酸化的受体，抑制其功能活性 arrestin 已克隆、定位11q13。 反响减弱迟发相减量调理down-regulation机制：受体-配体复合物内吞，导致外表受体数量减少，发现 arrestin可直接与Clathrin结合，在内吞中起adeptors作用； 受体减量调理与内吞后受体的分选有关。磷脂酰肌醇信号通路“双信使系统反响链：胞外信号分子G-蛋白偶联受体激活细胞质膜上的 IP3胞内Ca2+浓度升高Ca2+结合蛋白(CaM)细胞反响 磷脂酶C(PLC) 使细胞质膜上的PIP2 水解

23、DG激活PKC蛋白磷酸化或促Na+/H+交换使胞内pH升高PIP2：4，5-二磷酸磷脂酰肌醇 PKC 蛋白激酶CIP3： 1，4，5-三磷酸肌醇DG：二酰基甘油受体酪氨酸激酶及RTK-Ras蛋白信号通路受体酪氨酸激酶receptor tyrosine kinases，RTKs包括6个亚族信号转导：配体受体受体二聚化受体的自磷酸化激活RTK胞内信号蛋白启动信号传导RTK- Ras信号通路：配体RTK adaptor GRFRasRafMAPKKKMAPKKMAPK进入细胞核其它激酶或基因调控蛋白转录因子的磷酸化修钸。G蛋白偶联受体介导的MAPK的激活 RTKs的失敏desensitization

24、G蛋白偶联受体介导的MAPK的激活MAPKMitogen-activated protein kinase又称ERKextracelular signal-regulated kinase真核细胞广泛存在的Ser/Thr蛋白激酶。 MAPK的底物：膜蛋白受体、酶、胞浆蛋白、核骨架蛋白、及多种核内或胞浆内的转录调控因子在细胞增殖和分化中具有重要调控作用。PTX敏感性G蛋白Gi，Go的亚基依赖于Ras激活MAPK，详细机制还有待深化研讨；PKC、PLC与G蛋白偶联受体介导的MAPK激活PKC和PLC 参与G蛋白偶联受体激活MAPK ： G蛋白偶联受体激活G蛋白； G蛋白亚基或 亚基激活PLC，促进

25、膜磷脂代谢； 磷脂代谢产物 DAG + IP3 激活PKC； PKC 经过Ras 或 Raf 激活MAPK ；由于PKC对钙的依赖性不同，所以G蛋白偶联受体 MAPK途径对钙要 求不同；PKA对G蛋白偶联受体 MAPK途径的负调控迄今未发现和制备出MAPK组成型突变dominant negative mutant，提示细胞难于忍受MAPK的继续激活MAPK的去活是细胞维持正常生长代谢所必需。主要机制：特异性的Tyr/Thr磷脂酶可选择性地使MAPK去磷酸化，封锁MAPK信号。cAMP ， MAPK ；cAMP直接激活cAMP依赖的PKA；PKA能够经过RTK或经过抑制Raf-Ras相互作用起负调控作用。RTKs的失敏：催化性受体的效应器位于受体本身，因此失敏即酶活性速发抑制。机制：受体的磷酸化修饰。EGF受体Thr654的磷酸化导致RTK活性的抑制，假设该位点产生Ala突变，那么阻止活性抑制，后又发现C端的Ser1046/7也是磷酸化位点。磷酸化位点所在的C端恰好是SH2蛋白的结合部位。引起受体磷酸化的激酶：PKC作用于Thr654；CaMK2Ca2+和CaM依赖的激酶2作用于Ser1046/7还发现：EGF受体是CDK的靶蛋白，提示和周期调控有关。RTK晶体构造研讨阐明， RTK激活后构成稳定的非抑制性构象；磷酸化修饰后，构成抑制性构象，引起失敏。RTK失