测定叶绿素a和b的方法及其计算

1、实验二十五 测定叶绿素a和b的方法及其计算时间：2021.01.01创作欧阳美一目的要求：熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和 b的方法及其计算。二实验原理：如果混合液中的两个组分，它们的光谱吸收峰虽然有 明显的差异，但吸收曲线彼此有些重叠，在这种情况下要分 别测定两个组分，可根据Lambert-Beer定律，通过代数方 法，计算一种组分由于另一种组分存在时对光密度的影响， 最后分别得到两种组分的含量。如图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线，叶绿素a的最 大吸收峰在663nm,叶绿素b在645nm,吸收曲线彼此又有 重叠。图z-4叶绿素a和b的吸收光谱曲线横坐标为波长（mn）,纵坐标为

2、比吸收系数根据Lambert-Beer定律，最大吸收光谱峰不同的两个组 分的混合液，它们的浓度C与光密度0D之间有如下的关 系：0Dl=Ca kal+Cb kbl（1）0D2=Ca ka2+Cb kb2（2）式中：Ca为组分a的浓度，g/LoCb为组分b的浓度，g/Lo0D1为在波长入1 （即组分a的最大吸收峰波长）时，混 合液的光密度0D值。0D2为在波长入2 （即组分b的最大吸收峰波长）时，混 合液的光密度0D值。koi为组分a的比吸收系数，即组分Q当浓度为lg/L 时，于波长X 1时的光密度0D值。kb2为组分b的比吸收系数，即组分b当浓度为lg/L 时，于波长入2时的光密度0D值。ka

3、2为组分a （浓度为lg/L）,于波长入2时的光密度 0D值。kbl为组分b （浓度为lg/L）,于波长入1时的光密度0D值。从文献中可以查到叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为lg/L时，比吸收系数k值如下:波长（nm）叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入上式（1）、（2）,则得:0D663二82. 04X5+9. 27XCb 0D645二 16. 75X5+45. 60XCb经过整理之后，即得到下式:5二0.0127 OD663-0.00269 0D645Cb=0.0229 0D645-0.00468 0D663如果把Ca, Cb的浓度单位从原

4、来的g/L改为mg/L,则上式可改写为下列形式：Ca=12.70D663-2.690D645Cb二22. 90D645-4.680D663CT二 Ca+Cb=8.02 0D663+20. 210D645（5）（5）式中CT为总叶绿素浓度，单位为mg/Lo利用上面（3）、（4）、（5）式，即可计算出叶绿素a和b及总叶绿素的浓度（mg/L）。附注一般大学教学实验室所用的分光度计多为721型，属 低级类型，其单色光的半波宽要比中级类型的751型宽得多，而叶绿素3和b吸收峰的波长相差仅18nm （663-645nm）,难以达到精确测定。此外有时还由于仪器本身的 标称波长与实际波长不符，测定的正确性就更

5、差，不适用于 测定。751型有时也由于波长不够准确，会带来一定误差。可用叶绿素对波长进行校正。为校正仪器波长所需的叶绿素a和b的需要量很少，用 纸层析法很快就能分离制得。取植物叶子约lg,用乙瞇提取 叶绿体色素，再用毛细管将色素溶液画在3mm厚滤纸上使成 一宜线，为使分离效果好，一般重复点样一次即可。然后于 密闭容器中进行上行层析，溶剂为含有0.5%丙酮的石油瞇。 层析结束，用剪刀小心地剪下蓝绿色的叶绿素a和黄绿色的 叶绿素b,注意剪时尽量避开分层不清晰的色区。最后分别 浸于80%丙酮中，洗下叶绿素a和b。三 实验器材与试剂：1.实验仪器 高级型分光光度计、 离心机、台天平、剪刀、研钵、漏斗、

6、移液管。2实验试 剂 丙酮、碳酸钙。3.实验材料 植物叶片。四 操作步骤： 1、色素的提取：取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎 块，称取0. 5g放入研钵中加纯丙酮5ml,少许碳酸钙和石 英砂，研磨成匀浆，将匀浆转入量筒中，并用适量80%丙酮 洗涤研钵，用80%丙酮定容至10ml,吸取2. 5ml加入有 10ml80%丙酮的量筒中，过滤，滤液备用。2、测定光密度： 取上述色素提取液4ml,转入比色杯中，以80%丙酮为对 照，分别测定663nm. 645nm处的光密度值。3、按公式(3)、(4)、(5)分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度。再根据稀释倍数分别计算每g 鲜重叶片中色素的含量。【注意事项】1由于植物叶子中含 有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮的 最终浓度近似80%。2.由于叶绿素a. b的吸收峰很陡，仪 器波长稍有偏差，就会使结果产生很大的误差，因此最好能 用波长较正确的高级型分光光度计。五作业：1、试比较阴 生植物和阳生植物的叶绿素a