LncRNA研究之lncRNA芯片分析

1、LncRN颂究之IncRNA芯片分析LTLncRNA研究之IncRNA芯片分析IncRNA芯片分析L归一化IncRNA芯片采用的归一化的方法为 quantile normalization。2.差异 LncRNA 的筛选 IncRNA芯片中既有IncRNA的探针又有mRNA的探针，分 别做差异基因的筛选，筛选方法同表达谱的筛选方法是一致 的，参见表达谱的差异基因筛选。3.差异IncRNA的重注 释IncRNA芯片注释不完善，因此需要将筛选出来的IncRNA 进行重注释。将差异IncRNA在基因组上位置上下游延伸， 以寻找IncRNA附近的有功能的基因。4.差异IncRNA靶基因的预测IncRN

2、A可能通过调控相应的 mRNA发挥功能，因此有必要预测IncRNA的靶基因。我们 提取差异IncRNA和mRNA的序列，首先用blast进行初筛, 之后用RNAplex进行进一步筛选，以预测IncRNA可能调控 的 mRNAo.差异IncRNA与靶基因共表达网络预测出IncRNA的靶基因后，并可进一步在mRNA的数据中探寻该mRNA是否发 生表达量的变化。由此构建差异IncRNA与靶基因相互作用 网络图。.差异IncRNA与差异mRNA的共表达分析SBC Human IncRNA芯片能同时检测出差异表达的IncRNA和mRNA。我们将差异IncRNA和差异mRNA在一组样品中进行共表达 分析，

3、可以发现与某个IncRNA具有相同表达模式的mRNAo 要求：每组数据3个或3个以上生物学重复 实验组： 对照组：7.差异IncRNA靶基因的GO analysis对IncRNA 的靶基因进行GO Ontology的生物学的分类，根据Fishers Exact Test彳导到p-value,得到IncRNA靶基因对应的显著性 功能，从而了解IncRNA的功能0 8.差异IncRNA靶基因 的pathway analysis对IncRNA靶基因按照Pathway的主要 公共数据库KEGG和Biocarta来进行分类，对Pathway中 的基因进行基于离散分布的显著性分析，得到与实验目的有 显著联

4、系的Pathway分类,由这些pathway对应相应的靶基 因，从而获得该分类即导致IncRNA差异的最重要Pathwayo 9.差异IncRNA的转录因子的预测提取IncRNA TSS的上游 2000bp,下游500bp，利用HMM的算法根据TRANSFAC8.1 数据库预测其转录因子。10.IncRNA cis作用机制研究：对 于感兴趣的差异表达IncRNAs,搜索其上下游100K范围内 的所有编码基因，并与该IncRNAs有显著共表达的基因取 交集。这些在基因组上临近、且表达模式上共表达的基因很 可能被该IncRNAs所调控。11. IncRNA trans作用机制研究：计算LncRNA

5、s共表达的 编码基因，集合与转录因子/染色质调控复合物的靶基因集合 的交集，利用超几何分布计算该交集的富集程度，得到与 IncRNAs显著相关的转录因子，从而识别可能与IncRNAs联合发挥调控作用的转录因子 /染色质调控因子。综述长链非编码 RNA (IncRNA) IncRNA长链非编码 RNA (long noncoding RNA , IncRNA )是一类不编码蛋白的 RNA 分子， 长度在200bp以上，起初被认为是 RNA聚合酶II转录的 副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明IncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控，尤其在肿

6、瘤当中发挥了重要的 调控角色，如染色质修饰、转录激活和抑制、转录后调解以 及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等。随着高通量 测序技术的发展，越来越多的IncRNA被注释，但是绝大多数的IncRNA的功能仍然不清楚，因此IncRNA 的研究是一 片非常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。IncRNA 介绍长链非编码 RNA (long non-coding RNA , IncRNA )是一类转录本长度超过 200nt、不编码蛋白的 RNA。 lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学 功能。然而，近年来的研究表明lncRNA能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达

7、，参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输 等多种重要的调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治都 有着密切联系。为何细胞不惜耗费能量对这些非编码RNA的表达和定位进行严格调控呢？这些RNA分析究竟有何功能？ RNA测序技术的发展使人们得以初窥这一神秘分子，现在IncRNA的许多相关信息都可以再新数据库中查到，例如Broad研究所、哈佛大学和麻省理工共同开发的HumanBody Map lincRNAs catalog 。虽然近年来关于 IncRNA 的 研究进展迅猛，但是现在人们了解到的lncRNA只是冰山一角，绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。随着

8、研究 的推进，各类lncRNA的大量发现，lncRNA的研究作为RNA 研究的新领域，已经成为一个非常吸引人的方向，有待广大 科学家去探寻。lncRNA研究当前面临的一个主要挑战是， 研究工具还在不断开发和改进中，而lncRNA研究中非常关键的一步就是发现与特定疾病相关的lncRNA o现阶段，基因芯片技术发展趋于成熟稳定，在此平台上，通过设计不同 检测lncRNA探针筛选lncRNA是一种准确快捷的方法。lncRNA 特征lncRNA 通常较长，具有 mRNA 样结构，有些 具有poly(A)尾巴，有些没有poly(A)尾巴，分化过程中有动 态的表达与不同的剪接方式，与编码基因相比，lncR

9、NA表达量更低。冰 组织特异性：不同组织之间的lncRNA表达量不同。X时空特异性：同一组织或器官的不同生长阶段，其 中的lncRNA表达量也会变化。X lncRNA启动子同样可以 结合转录因子，如 Oct3/4 , Nanog , CREB, Sp1 , c-myc , Sox2与p53，局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰方式 与结构特征。派大多数的lncRNA在组织分化发育过程中， 都具有明显的时空表达特异性，如有人针对小鼠的1300个IncRNA进行研究，发现在脑组织中的不同部位，IncRNA具有不同的表达模式。派在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达 方式。IncRNA的亚细胞位置上也呈多

10、样化，在细胞核、 细胞质和细胞器均有分布，甚至某些IncRNA具有独特的亚细胞位置，有可能是全新的亚细胞构成。IncRNA功能IncRNA可从染色质重塑、转录调控及转录后 加工等多种层面实现对基因表达的调控：a） IncRNA通过招募染色质重塑复合物至特定的基因组位点使其发生催化活 性。如 HOTAIR21 , Xist、RepA 和 Kcnqotl 招募 Polycomb complex 至HoxD 位点，使得 X染色体或 Kcnq1功能域的 组蛋白H3第27位赖氨酸发生3甲基化（me3K27 ）,诱导 异染色质形成，从而抑制该区域基因表达。b） lncRNA通过多种机制进行转录水平调控。l

11、ncRNA结合到基因cyclin D1上，招募RNA结合蛋白TLS来调控蛋白CBP和p300的组 蛋白乙酰转移酶活性，进而抑制cyclin D1转录。c）超保守增强子转录由lncRNA-Evf2 ,该lncRNA能激活转录因子 DLX2 ,进而调控基因 Dlx6转录。d） DHFR次要启动子区域 转录由的lncRNA与该基因主要启动子区域结合形成三聚 体，抑制转录因子TFIID结合，从而使基因DHFR发生沉默。 e）反义lncRNA能够与剪接体（splicesome ）中锌指同源 mRNA Zeb2的5剪切位点结合，使内含子未被剪切掉，而 该内含子序列中保留有内部核糖体进入位点（IRE位点），

12、翻 译过程中识别并结合该位点，导致 Zeb2基因表达和翻译, IncRNA分子机制随着IncRNA功能逐步显现，具与靶点的作用机制成为进一步的热点。早期认为原位调控是LncRNA作用的唯一机制，它通过招募形成染色质修饰复合物而沉默 邻近基因转录，例如 IGF2R反义RNA（antisense of IGF2RRNA ,AIR）、XIST 等。而 Hox 基因反义基因间 RNA（Hox antisense intergenic RNA , HOTAIR）的发现提示 LncRNA 可能存在远程调控。同源异型基因（homeotic genes , HOX）在细胞增殖与定向分化中起关键作用，人类Hox

13、基因簇约含100个ncRNA 基因，其中 HOTAIR定位于HOXC基因座 12q13.13 o HOTAIR的5端可招募结合多梳蛋白抑制复合物 2（polycomb repressive complex2 , PRC2）,借助 PRC2 上 三个H3K27甲基化酶 EZH2、SUZ12和EED,使另一基因座 HOXD上长约40kb的序列转录沉默，从而在乳腺上皮细胞 内使细胞内转录倾向于胚胎成纤维细胞样表型。超过20%的LncRNA能够通过结合PRC2或其他类似复合物发挥作用， 提示LncRNA的远程调控机制在生物体内广泛存在。其作用机制如下图所示，主要包括以下几种情况：1）在编码蛋白基因的上游启动子区（橘色）转录，从而干扰邻近蛋白编码基因（蓝色）的表达（如醉母SER3基因）；2）抑制RNA聚合酶n,或介导染色质重构和组蛋白修饰，而 影响基因（蓝色）表达；3） lncRNA （紫色）与编码蛋白基因的