细胞免疫荧光步骤(干货分享)

1、细胞免疫荧光步骤方法一：1首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包 被过的玻璃片）然后在4%PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX100室温下作用1 2分钟使细胞膜通透。接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。4 剪一片合适大小的para film,在上面滴上稀释在1%BSA/TB. S中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片3 0ul 足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育3 0分钟， 然后在PBS里洗三次。5.接下来二抗孵育步骤同上。6 最后，在载玻片加上mounti

2、ng medium（大约每个玻璃片加10u. 1）,把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就 可以在荧光显微镜下观察了。7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下 你的抗体，看看有没有杂带。8 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是 直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一 起加。方法二：1选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabb it和rat的抗体,二抗则是不同荧光信号标记 的，我用的是donkey anti rabbi tFITC （绿）和 do n key an

3、ti- r at- Tex Red （红）。我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育.抗体浓 度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过 夜比较好， 背景比较清晰。我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和 大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey 血清.其余步骤同一般免疫荧光单标操作.方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在2 4 wel1 /12well/ 9 6w e ll中直接染色2细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要 是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚

4、赖氨酸处理后让 细胞自己爬片细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。其实小的we 1 l的话，可以直接拿来染色，没问题的。5固定:用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲 醛;酒精.。）固定细胞。&内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连 HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）.7通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做;细胞膜蛋白不需要做），一 般选用TritonX10。来做细胞通透，浓度和时间需要摸索， 一般是0。15%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1 2 小时。8.封闭:洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS 中封闭半小时，也可以

5、选用510%脱脂奶粉。封闭结束后 千万不要洗,直接上一抗。9 一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如Santa cru .ze,Abc am,s igma.o.选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓 度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于 新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一 抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。感谢聆听10.洗去一抗。11上二抗,二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个 就行了，自己选国产的也行,就是选在哪个动物体内做的一抗, 二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的， 抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小 时

6、。12底物显色(选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书 添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假 阳性；二抗连得是荧光报告的不用做)洗去二抗，染核DAP I 或者 Hoechst 染核洗去染核液，加PBS,上镜观察。方法四：细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时,将细胞接种到预先放 置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出 盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS 离心洗涤(1 0 0 0rpm,5min) 2次，用细胞离心甩片机制备细胞 片或直接制备细胞涂片。感谢聆听(2)固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细 胞可置于含叠

7、氮纳的PBS中4C保存3个月。PBS洗涤3X5 min。 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入 抗体孵育前,对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部 位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质.通透的时间一般在 5-1 5 min。通透后用PBS洗涤3X5 min。 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。一抗结合。室温孵育1h或者4C过夜。PBST漂洗3次，每次 冲洗5min.(6)二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PB ST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次.封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。方法五：1.

8、漂洗血清蛋白PH7。2-7.4,37度 PBS 2小时.2： 20度甲醇固定2 0分钟后，自然、干燥10分钟PBS 洗净：3 min*31%Tr iton: 25min30min。配成 50ult r iton+ 5 ml p BS5 . PBS 洗净：2* 5 min6.羊血清封闭：37度,20分钟7 . 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者3 7度1-2小时4度 PBS 洗净，3min*5 次二抗37度小于一小时37 度 PBS 洗净,3*3min 凉干封片（封闭液PH8O5）细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己 要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净

9、，用水冲静烤干，然后泡 酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再 烤箱中大约8小时烤干备用。爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿 中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口 大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子 具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液 （注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧 密接触），将玻片小心放入摆放其中,然后将单细胞悬液一滴一滴 的滴到玻片上.最后盖上培养皿置于37度5%CO2的暖箱中培养, 根据细胞生长状况,2 4小时或

10、更长时间适时取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟,然后在4%多聚甲 醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意 手法轻柔，要不然掉片彳艮厉害。同时操作过程中注意玻片的正反 面，要不然真的是前功尽弃。将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。 注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻 片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在 -20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。2.4%多聚甲醛固定10min （固定细胞器用预冷的70%甲醇+ 3 0% 丙酮）；PBS 漂洗 5min；0.5% Triton穿孔15

11、min （丙酮固定法不用透化处理）；PBS漂洗2次，每次5m in;1%BSA封闭 3 0min;7 .加入1 %BSA稀释的一抗，于37C杂交2h；PBS漂洗2次，每次5m i n；加入1 %BSA稀释的二抗，于37C杂交1h;PB S漂洗2次，每次5min；1 1. 5ug/ml DAPI 染色 2min;12。抗淬灭封片剂封片。抗淬灭封片剂：2.5% DABCO （w/v）0mM Tris（pH8。0）90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min（固定细胞器用预冷的70%甲醇+3 0%丙酮）PB S 漂洗 5min0.5% T riton 穿孔 15min（丙酮固定法不用透化处理PBS漂洗2次，每次5min1%BSA 封闭 30min加入1 %BSA稀释的一抗，于3 7C杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1 %BSA稀释的二抗,于