细胞培养技术与安全课件

1、细胞培养技术与安全温超玮11-3-2016主要内容一. 细胞培养的条件及环境二. 细胞培养前的实验准备三. 细胞原代和传代培养四. 体外培养细胞分型五. 细胞培养基本技术六. 常见细胞污染及其处理方法七. 实验安全一. 培养细胞需要什么？条件：培养基（碳水化合物、无机盐、必需氨基酸、微量元素等）、血清（激素、生长因子等）、消化液（ 0.25胰蛋白酶）、缓冲液（磷酸盐等）、抗生素（青霉素、链霉素等）环境：恒定温度（37）、CO2 （抑制NaHCO3CO2反应，调节pH）、无菌（提供细胞生长的洁净环境）二. 前期试验准备？培养基（DMEM、1640、DMEM/F12、L-15等）配制和除菌（0.2

2、2um过滤）。血清、胰酶、抗生素的购买和分装。缓冲液的配制（PBS、Hanks等）和灭菌（高压或0.22um过滤）。培养器皿（枪头、滴管、培养皿、培养瓶、离心管、试剂瓶等）的灭菌（高压）。隔离服（高压灭菌-干燥-紫外）、移液器（75%酒精-紫外）。细胞培养用器皿的清洗和消毒 一般玻璃器皿的清洗分为四个步骤：1、自来水浸泡2、洗涤剂刷洗(如有必要进行超声处理）3、泡酸（浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水）4、流水冲洗过夜，依次用蒸馏水、三蒸水漂洗，最后烘干备用 常用消毒方法：1、湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌），121摄氏度，1530min2、过滤除菌(如：血清的除菌）三. 原代培养和传代原代培养取自体内新鲜组

3、织或细胞并置于体外条件下生长，到第一次传代之前的阶段。特性：一般可持续培养1-4周。可见细胞分裂，但不旺盛，呈二倍体核型。与体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。三. 原代培养和传代传代培养细胞在体外环境中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中在进行培养的过程。特性：细胞增殖旺盛，在细胞全生命期中持续时间最长。30代内大部分可维持二倍体核型，为有限细胞系。传代30-50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，甚至完全停止或衰退凋亡。可通过转化获得无限繁殖能力，成为无限细胞系。 （一）贴壁型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型

4、： 1.成纤维细胞型 2.上皮型细胞 3.游走细胞型 4.多型细胞型四. 体外培养细胞的分型胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。包括成纤维细胞，中胚层起源的心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞，以及培养中细胞形态与成纤维类似者。 1. 成纤维细胞型成纤维细胞 心肌细胞细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 2. 上皮型细胞 肾小管上皮细胞 乳腺上皮细胞 3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞

5、不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4、多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 多型细胞型（神经细胞） 游走细胞型 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖，可聚集形成细胞团。 （二）悬浮型细胞 悬浮型细胞分析多个STR基因座，可以准确判断交叉污染和细胞类型。高度灵敏，可以检测最低0.1ng DNA。人类细胞16个的基因座检测。小鼠细胞8个高度多态性位的基因组检测。人-鼠细胞交叉污染检测。细胞悬液（细胞数106个）或基因组DNA（ 20L，浓度 50ng/L）。细胞鉴定STR基因分型五

6、. 细胞培养基本技术换液消化和传代冻存复苏贴壁细胞 直接换液：弃去旧培养液PBS洗涤细胞加入新培养液悬浮细胞 半定量换液：弃去1/3-1/2的旧培养液加入新培养液1. 细胞换液贴壁细胞 弃去旧培养液PBS洗涤细胞 加入胰酶消化，弃去胰酶加入新培养液，吹打混匀细胞悬液分瓶（皿），补充培养液悬浮细胞 全部细胞转移至15ml离心管，1000rpm离心5min弃去旧培养液，PBS洗涤细胞1000rpm离心5min，弃去PBS 加入新培养液，吹打混匀细胞悬液分瓶（皿），补充培养液2. 细胞消化和传代3. 细胞冻存贴壁细胞 弃去旧培养液PBS洗涤细胞 加入胰酶消化，弃去胰酶加入培养液终止消化，吹打混匀并行

7、细胞计数加入冻存培养液（含30%血清+10%DMSO），吹打混匀转移至冻存管，缓慢降低温度至-196 。悬浮细胞 全部细胞转移至15ml离心管，1000rpm离心5min弃去旧培养液，PBS洗涤细胞1000rpm离心5min，弃去PBS 加入新培养液，吹打混匀并行细胞计数 加入冻存培养液（含30%血清+10%DMSO），吹打混匀转移至冻存管，缓慢降低温度至-196 。贴壁细胞与悬浮细胞一致。 迅速取出冻存管，于37-40水浴1-2min内快速搅动，以融化细胞冷冻块将细胞全部转移至15ml离心管，补充新培养液至总体积约10ml1000rpm离心5min，弃上清加入新培养液，吹打混匀细胞悬液分瓶（

8、皿），补充培养液4. 细胞复苏细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存细胞存活率。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，

9、提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。*DMSO在常温下对细胞有毒性，且需常温避光保存。慢冻程序： -4，20-40min；-20，40-60min；-80，过夜；液氮（-196 ）长期冻存。快融步骤： 37-40水浴快速搅动，在1min内融化细胞转移细胞至15ml离心管，补充新培养液至总体积约10ml，稀释DMSO的影响1000rpm离心5min，弃上清，加入新培养液细胞计数细胞计数结果以每ml细胞数表示。细胞计数的原理和方法与白细胞计数相同。 细胞数(个/mL)=(4大格的总数/4) 104

10、稀释倍数注：计上不计下，计左不计右六. 细胞污染白色念珠菌污染 丝状菌（霉菌）污染六. 细胞污染细菌污染（瑞氏染色） 细菌污染六. 细胞污染 支原体污染 支原体污染细胞污染怎么办？丢弃！无法丢弃？ 原则：排除后续外来污染；无限地稀释细菌的浓度；抗生素抑制霉菌或真菌生长；加强无菌操作。细菌污染-贴壁细胞倒掉污染培养基，瓶口或皿接触部位火焰灭菌。新鲜PBS晃动清洗，弃PBS，火焰灭菌，重复3-5次。加入双抗，晃动清洗，静置3-5min后吸出，重复2次。新鲜PBS晃动清洗1-2次。加入含有10-20%双抗的培养液，培养5h。弃培养液，新鲜PBS清洗2次，胰酶消化，1000rpm离心3min。弃上清-

11、PBS重悬-离心2次，加入含有10-20%双抗的培养液，换皿培养24h后观察。根据污染情况，考虑是否重复以上步骤，或放弃细胞。其他污染-贴壁细胞霉菌或真菌：双抗改为两性霉素B（终浓度一般为2.5g/ml ）或制霉菌素或放线菌素D（3g/ml ），其余操作同前。支原体：泰乐菌素（终浓度一般为2.5g/ml ）。小窍门-贴壁细胞形态不好？传代前，细胞生长汇合度不要超过70%（特定实验要求除外）。持续传代超过3个月（或者代数超过50代）：复苏代数较低的细胞。“二传”细胞：消化前，无血清培养基预“吹洗”一次；PBS清洗+胰酶消化，加入全培养基后分皿；根据细胞贴壁情况（2-6h），吸弃未贴壁细胞，无血清

12、培养基“轻洗”一次，再加入全培养基。24-48h换液。分皿前尽可能吹打成单个细胞，无细胞抱团现象。更换较好的血清，适当提高培养基内血清浓度。小窍门-背景不干净（排除污染）？细胞状态不好（参见前面）。PBS 洗涤后，胰酶“润洗”一次（注意控制时间），吸弃上清。收集消化的细胞，1000rpm离心3min，吸弃上清，加入全培养基轻柔吹打悬浮细胞后分皿。七.实验安全仪器操作试剂1.仪器操作CO2： 打开顺序：培养箱开气瓶开减压阀开。 关闭顺序：气瓶关减压阀关培养箱关。液氮罐： 佩戴防冻手套和护目镜；稍提起冷冻架，倾斜片刻使液氮流回罐内后再将架子拎出；速度轻柔且迅速，取物时记得关闭液氮罐盖子。1.仪器操作酒精灯： 酒精灯的灯芯要平整，如以烧焦或不平整，要用剪刀修正。添加酒精不得超过总容积的2/3，且不少于1/4。 禁止向燃着的酒精灯里添加酒精。 禁