药物分析学课件：第六章 芳酸类非甾体抗炎药物的分析

1、第六章芳酸类非甾体抗炎药物的分析 2022/8/412022/8/42第六章熟悉: 主要芳酸类非甾体抗炎药物杂质的结构,危害,检查方法与限度 了解: 影响芳酸类非甾体抗炎药物稳定性的主要因素,体内样品与临床监测 掌握: 芳酸类非甾体抗炎药的结构和性质 主要芳酸类药物的鉴别,检查和含量测定的原理与特点 2022/8/43第六章芳酸类非甾体抗炎药物的分析 典型药物的结构与性质 鉴别试验特殊杂质及其检查法含量测定4123体内药物分析52022/8/44概述结构特点药物特点理化特性分析方法作用临床基本结构基本性质鉴别,检查含量测定;体内分析抗炎, 抗风湿, 止痛, 退热 关节炎, 发热, 慢性疼痛芳基

2、取代羧酸游离羧基和苯环酸性; 水解性; 光谱特性基团(酚)/元素 (硫)特性Fe3+; UV, IR, LC中间体或水解产物酸碱滴定; UV; HPLC体内过程与分析非甾体抗炎药(NSAIDs)是一类不含有甾体骨架的抗炎药, 是目前临床使用最多的药物种类之一Non-SteroidAnti-InflammatoryDrugs2022/8/45第一节典型药物的结构与性质一、典型药物与结构特点 二、主要理化性质2022/8/46一、典型药物与结构特点 苯环结构特征 (1)邻羟基苯甲酸类:具有苯环和羧基水杨酸阿司匹林双水杨酯二氟尼柳2022/8/47一、典型药物与结构特点 苯环结构特征 （2）邻胺基苯

3、甲酸:甲芬那酸（3）二苯甲酮:酮洛芬2022/8/48一、典型药物与结构特点 苯环结构特征 （4）羟基不饱和酮: 吡罗昔康, 美洛昔康（5）杂环，特殊元素: 吲哚美辛, 吡罗昔康, 美洛昔康吡罗昔康美洛昔康吲哚美辛2022/8/49一、典型药物与结构特点 羧基状态 （1）游离:水杨酸,阿司匹林,双水杨酯,二氟尼柳,甲芬那酸,布洛芬,酮洛芬,萘普生,吲哚美辛 水杨酸 阿司匹林 双水杨酯 布洛芬2022/8/410一、典型药物与结构特点 羧基状态 （2）羧基成盐/酯:双氯芬酸钠,双水杨酯双水杨酯双氯芬酸钠2022/8/411一、典型药物与结构特点 羧基状态 （3）酰胺:吡罗昔康,美洛昔康 吡罗昔康

4、美洛昔康2022/8/412一、典型药物与结构特点 其他类 对乙酰氨基酚（扑热息痛，泰诺，百服宁） 2022/8/413二、主要理化性质 (一) 酸性较强酸性: 原料药可在中性乙醇或甲醇,丙酮等水溶性有机溶剂中,用氢氧化钠直接滴定双氯芬酸,布洛芬,酮洛芬,萘普生,吲哚美辛: 羧基不与苯环直接相连, 酸性较弱吡罗昔康,美洛昔康,尼美舒利,对乙酰氨基酚:酰胺结构, 无明显酸性 3.49 2.95pKa = 4.26邻位效应 分子内氢键2022/8/414二、主要理化性质 (二) 水解性酯键:阿司匹林/双水杨酯酰胺键:吲哚美辛,吡罗昔康,美洛昔康,尼美舒利,对乙酰氨基酚水解反应及其产物的特性反应鉴别

5、水解可快速,定量含量测定(剩余碱量法)美洛昔康 定过量的氢氧化钠水解 剩余的氢氧化钠用盐酸回滴定美洛昔康2022/8/415二、主要理化性质 (三) 吸收光谱特性紫外特征光谱 :鉴别;含量均匀度,溶出度/释放度红外特征光谱 :鉴别酮洛芬酚羟基:对乙酰氨基酚,水杨酸与Fe3+显色鉴别 二苯甲酮:酮洛芬与苯肼缩合显色鉴别 硫:美洛昔康热分解后产生的硫化氢与醋酸铅生成黑色硫化铅鉴别(四) 基团/元素特性2022/8/416第二节 鉴别试验一、与三氯化铁反应二、缩合反应三、重氮化-偶合反应四、氧化反应五、水解反应六、特征元素反应七、光谱法八、色谱法2022/8/417一、与三氯化铁反应中性或弱酸性(p

6、H值46)条件下进行, 强酸性溶液中配位化合物分解阿司匹林 加水煮沸双水杨酯 在氢氧化钠试液中煮沸水解生成水杨酸, 与三氯化铁试液显紫堇色二氟尼柳 于乙醇中与三氯化铁试液呈深紫色 1. 水杨酸反应2022/8/4182022/8/419一、与三氯化铁反应对乙酰氨基酚:水溶液加三氯化铁试液显蓝紫色吡罗昔康(三氯甲烷): 与三氯化铁显玫瑰红色美洛昔康显淡紫红色 烯醇式羟基具有酚羟基性质,与FeCl3生成红色配位化合物2. 酚羟基反应2022/8/420一、与三氯化铁反应2022/8/421二、缩合反应酮洛芬的二苯甲酮, 在酸性下与二硝基苯肼缩合生成橙色偶氮化合物沉淀2022/8/422三、重氮化-

7、偶合反应对乙酰氨基酚在酸中水解生成对氨基酚, 游离芳伯氨基与亚硝酸钠试液重氮化, 重氮盐再与碱性-萘酚偶合生成红色偶氮化合物 2022/8/423三、重氮化-偶合反应2022/8/424四、氧化反应甲芬那酸: 溶于硫酸, 被重铬酸钾氧化显深蓝色随即变为棕绿色吲哚美辛: 溶液在硫酸酸性下与重铬酸钾溶液共热, 被氧化显紫色在盐酸溶液中与亚硝酸钠溶液反应显绿色, 放置后渐变黄色 2022/8/425四、氧化反应2022/8/426五、水解反应阿司匹林, 水解得水杨酸钠与醋酸钠, 酸化生成水杨酸白色沉淀; 并发生醋酸的臭气双水杨酯水解后酸化, 生成白色水杨酸沉淀;2 CH3COONa + H2SO4

8、2 CH3COOH +Na2SO42022/8/427五、水解反应2022/8/428六、特征元素的反应氯的鉴别与碱共热分解产生氯化物, 显氯化物的鉴别反应双氯芬酸钠: 与碳酸钠炽灼灰化, 加水煮沸, 滤过, 滤液显氯化物鉴别反应 硫的鉴别经高温分解产生硫化氢气体, 遇醋酸铅生成硫化铅黑色沉淀美洛昔康: 试管中炽灼, 产生的气体使湿润的醋酸铅试纸显黑色2022/8/429六、特征元素的反应2022/8/430鉴别试验D水杨酸及其盐在中性或弱酸性条件下与_ 反应，生成紫堇色配位化合物。 FeCl3122022/8/431鉴别试验配伍 A 与碳酸钠试液加热溶解，再加过量稀硫酸酸化后生成白色沉淀，并

9、发出醋酸的臭气B 加酸水解，在酸性条件下，与亚硝酸钠，碱性-萘酚反应，显红色C 加乙醇溶解后，加二硝基苯肼，加热煮沸，放冷即产生橙色沉淀D 溶于硫酸后，与重铬酸钾反应显深蓝色，随即变为棕绿色。1 甲芬那酸- （ ） 2 酮洛芬- （ ） 3 阿司匹林- （ ） 4 对乙酰氨基酚- （ ） ABCD2022/8/432鉴别试验现有三瓶药物分别为水杨酸（A)，阿司匹林（B）和对乙酰氨基酚（C)，但瓶上标签脱落，采用适当方法将三者区分开。（1）加甲醇溶解，加水与三氯化铁，紫色-水杨酸（2）剩下两种药物，加稀盐酸，加热煮沸，放冷后加亚硝酸钠和碱性-萘酚，显红色-对乙酰氨基酚2022/8/433七、光谱

10、法(一) 紫外-可见分光光度法最大吸收波长法: 双氯芬酸钠溶液: 276nm有最大吸收; 吡罗昔康片,含量测定溶液: 243与334nm最大吸收最大与最小吸收波长法: 布洛芬及制剂氢氧化钠溶液: 265,273nm最大吸收;245,271nm最小吸收;259nm肩峰吸光度法: 甲芬那酸盐酸-甲醇溶液: 279与350nm最大吸收。吸光度(20g/ml)分别:0.690.74与0.560.60吸光度比值法: 二氟尼柳盐酸-乙醇溶液: 251与315nm最大吸收吸光度比值应为4.24.6 2022/8/434七、光谱法(二) 红外分光光度法阿司匹林 峰位(cm-1)归属33002300vO-H(羧

11、基)1760, 1690vC=O(羧酸酯和羧酸)1610, 1570, 1480, 1460vC=C(苯环)1310, 1230, 1180vC-O(羧酸酯和羧酸)775Ar-H(邻位取代苯环)330023001760,169016101460131011807752022/8/435红外光谱法原料药2022/8/436八、色谱法(一) 薄层色谱 个别药物制剂采用溶剂提取法去除辅料后IR鉴别;部分药物制剂采用TLC鉴别: 二氟尼柳, 美洛昔康等 2022/8/437(二) 高效液相色谱法随着HPLC在药物制剂含量测定中的大量应用, 更多应用HPLC进行制剂的鉴别:阿司匹林等多种制剂均直接取含量

12、测定项下记录的HPLC色谱图进行鉴别 当TLC和HPLC均有收载时: 二者可任选其一。如美洛昔康片的鉴别八、色谱法2022/8/438药物名称特殊杂质游离水杨酸与有关物质/FeCl3阿司匹林/双水杨酯甲芬那酸二氟尼柳第三节特殊杂质及其检查法2.3-二甲基苯胺有关物质 6-甲氧基-2-萘乙酮 氨基酚和对氯苯乙酰胺A.TLC; B.HPLCGC萘普生对乙酰氨基酚2022/8/439一、阿司匹林与双水杨酯(一) 阿司匹林与双水杨酯的合成2022/8/440一、阿司匹林与双水杨酯(二) 阿司匹林中游离水杨酸与有关物质1. 游离水杨酸: 酚羟基易被空气(氧)逐渐氧化生成淡黄,红棕至深棕色醌型化合物202

13、2/8/4411. 游离水杨酸: ChP 用水杨酸与 Fe3+ 生成紫堇色配离子的原理, 用稀硫酸铁铵溶液显色法检查 供试品溶液制备过程中阿司匹林水解 ChP2010采用1%冰醋酸甲醇溶液制备供试品溶液(防阿司匹林水解); 并用RP-HPLC检查 一般，制剂不再检查 原料药下的相关杂质，但是阿司匹林制剂过程中会水解生成水杨酸，所以药典对阿司匹林制剂也规定检查水杨酸的含量。2022/8/4421. 游离水杨酸:2022/8/4432. 有关物质:阿司匹林中“有关物质”系指除“游离水杨酸”外的合成原料(苯酚)及副产物2022/8/4442. 有关物质:阿司匹林 水杨酸 乙酰水杨酰水杨酸a:阿司匹林

14、供试品(10mg/ml)；b:0.5%自身对照(50g/ml)；c: 0.05%自身对照(灵敏度试验5g/ml)；d:水杨酸对照(10g/ml)；e:空白2022/8/4452. 有关物质:2022/8/446一、阿司匹林与双水杨酯(三) 双水杨酯中游离水杨酸利用水杨酸与三价铁生成有色配离子的原理, 用硝酸铁溶液显色, 在530nm的波长处测定吸光度, 限度为0.5%; 双水杨酯片同法检查, 限度为1.5% 2022/8/447双水杨酯中游离水杨酸2022/8/448二、甲芬那酸(一) 合成工艺 甲芬那酸主要以邻-氯苯甲酸(o-chloroben- zoic acid)和2,3-二甲基苯胺(2

15、,3-dimethyl- aniline)为原料, 在铜的催化下缩合而成 2022/8/449二、甲芬那酸(二) 2,3-二甲基苯胺的检查 ChP曾采用HPLC法检查: 单1杂质的限量为0.1%杂质总量为0.5%ChP2010规定HPLC法检查: “有关物质”GC检查: 2,3-二甲基苯胺(0.01% ) 2022/8/450三、二氟尼柳(一) 合成工艺 原料(I) : 2,4-二氟苯胺中间体(II): 2,4-二氟联苯中间体(III) : 4-(2,4-二氟苯基)苯乙酮中间体(IV) : 4-(2,4-二氟苯基)苯酚乙酯中间体(V): 4-(2,4-二氟苯基)苯酚产品(VI): 二氟尼柳20

16、22/8/451三、二氟尼柳(二) 有关物质A和B的检查 1. 有关物质A的检查TLC(正相): 极性较小的杂质单1杂质的限量为0.5%2. 有关物质B的检查HPLC(反相): 极性较大的杂质各面积的和为0.5%2022/8/452四、萘普生 (一) 合成工艺 原料(I) : 2-萘甲醚中间体(II): 6-甲氧基-2-乙酰萘(6-甲氧基-2-萘乙酮)中间体(III): 2-羟基-2-(6-甲氧基-2-萘基)丙酸产品(IV): 萘普生 2022/8/453四、萘普生(二) 6-甲氧基-2-萘乙酮及其它有关物质1. 溶液制备 供试品溶液: 0.5mg/ml流动相溶液 对照品溶液: 6-甲氧基-2

17、-萘乙酮(杂质I), 50g/ml 对照溶液: 供试品溶液1ml + 对照品溶液2ml200ml2. 限度 杂质I: 不得大于杂质I峰面积(0.1%) 其他单个杂质: 不得大于杂质I峰面积的2倍(0.2%) 各杂质总量: 不得大于对照溶液中萘普生峰面积(0.5%) 2022/8/454五、对乙酰氨基酚 (一) 合成工艺 (二) 有关杂质: 对硝基酚,对氨基酚,对氯苯胺,对氯苯乙酰胺,o-乙酰基对乙酰氨基酚,偶氮苯,氧化偶氮苯,苯醌和醌亚胺 1. 对氨基酚及(其它)有关物质HPLC 对氨基酚: 0.005% 有关物质: 单个0.1%; 总量0.5%2. 对氯苯乙酰胺(极性较小)HPLC (0.0

18、05%) 2022/8/455有关物质检查 检查阿司匹林中水杨酸是利用杂质与药物的（ ）A溶解行为的差异 B化学性质的差异 C熔点差异 D旋光性差异B2022/8/456有关物质检查 BCE多选2022/8/457第四节 含量测定一、酸碱滴定法二、紫外-可见分光光度法三、高效液相色谱法2022/8/458一、酸碱滴定法酸碱滴定法水解后剩余量滴定法阿司匹林 USP, BP, JP非水溶液滴定法吡罗昔康具有吡啶环, 显碱性, 可在冰醋酸溶液中用高氯酸滴定液滴定 剩余量滴定法美洛昔康水及与水混溶的有机溶剂中难溶,溶于氢氧化钠滴定液后盐酸回滴定 直接滴定法水杨酸,阿司匹林,双水杨酯,二氟尼柳,甲芬那酸

19、,布洛芬,酮洛芬,萘普生,尼美舒利2022/8/459(一) 直接滴定法1. 测定法本品约0.4g, 精密称定, 加中性乙醇(对酚酞指示液显中性)20ml溶解后,加酚酞指示液3滴, 用氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)滴定T=18.02mg2. 讨论滴定在不断振摇下稍快进行, 防阿司匹林水解受阿司匹林的水解产物水杨酸及醋酸的干扰3. 应用水杨酸,阿司匹林,双水杨酯,二氟尼柳,甲芬那酸,布洛芬,酮洛芬,萘普生及尼美舒利2022/8/460(一) 直接滴定法2022/8/461(二) 剩余量滴定法1. 原理美洛昔康含有与羰基共轭的烯醇式羟基, 具有羧酸性质, 可用氢氧化钠滴定液滴定本品甲醇,乙醇,

20、丙酮及水中难溶, 定量过量的氢氧化钠滴定液溶解后, 用盐酸滴定液回滴定2. 测定法本品约0.4g, 精密称定, 精密加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L) 25ml, 微温溶解, 加中性乙醇(对溴麝香草酚蓝指示液显中性)100ml与指示液10滴,用盐酸滴定液(0.1mol/L) 滴定; T=35.14mg2022/8/462(三) 水解后剩余量滴定法1. 原理阿司匹林酯结构在碱性溶液中易水解, 加入定量过量的氢氧化钠滴定液, 加热使酯键水解后, 再用硫酸滴定液回滴定剩余的氢氧化钠滴定液2NaOH + H2SO4Na2SO4 + 2H2O2. 测定法(USP32-NF27) BP2009 JP15

21、 本品约1.5g,精密称定,加氢氧化钠滴定液(0.5mol/L) 50.0ml,缓缓煮沸10min,放冷,加酚酞指示液,用硫酸滴定液(0.25mol/L)滴定; T=45.40mg2022/8/463(三) 水解后剩余量滴定法2022/8/464(三) 水解后剩余量滴定法3. 两步滴定法水解后剩余量滴定法的改进 阿司匹林片剂: 水解产物水杨酸及醋酸;稳定剂酒石酸或枸橼酸两步滴定法:第1步: 中和, 中和干扰物和阿司匹林的游离羧基第2步: 水解与滴定, 水解后剩余量滴定法阿司匹林片含量测定方法(ChP2005)如下: 本品10片,精密称定,研细,精密称取片粉(阿司匹林0.3g),中性乙醇(酚酞指

22、示液显中性)20ml, 振摇, 加指示液3滴,滴加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L) 至溶液显粉红色, 精密加氢氧化钠滴定液 (0.1mol/L) 40ml, 加热15min, 放冷, 用硫酸滴定液(0.05mol/L)滴定; T=18.02mg2022/8/465(三) 水解后剩余量滴定法含量计算供试品中阿司匹林的含量,由水解时消耗的碱量计算第1步: 中和时, 阿司匹林的游离羧酸中和第2步: 水解后剩余量滴定法时阿司匹林与氢氧化钠反应的摩尔比为1:1滴定度: T = 0.1(1/1) 180.16=18.02(mg/m1)片剂含量: 2022/8/466(四) 非水溶液滴定法1. 原理吡罗昔

23、康具有吡啶环, 显碱性, 可在冰醋酸溶液中用高氯酸滴定液滴定 2. 测定法本品约0.2g, 精密称定, 加冰醋酸20ml使溶解, 加结晶紫指示液1滴, 用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定至溶液显蓝绿色, 并将滴定的结果用空白试验校正T=33.14 mg/ml2022/8/467二、紫外-可见分光光度法(一) 直接分光光度法二氟尼柳,美洛昔康,尼美舒利制剂,对乙酰氨基酚及其部分制剂; 二氟尼柳胶囊含量测定:精密称取内容物适量(二氟尼柳0.1g),置100ml量瓶,加溶剂(0.1mol/L的盐酸乙醇溶液)适量,超声处理10min,用溶剂稀释至刻度, 摇匀, 滤过, 精密量取续滤液5ml, 置l

24、00ml量瓶, 用溶剂稀释至刻度,摇匀, 在315nm的波长处测定吸光度; 另取二氟尼柳对照品,用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含50g的溶液作为对照品溶液,同法测定, 计算式中, D为供试品溶液稀释体积(ml, D=100100/5=2000); 标示量为胶囊剂的规格(mg/粒) 2022/8/468二、紫外-可见分光光度法(二) 柱分配色谱-紫外分光光度法 USP32-NF27则采用柱色谱分离法消除阿司匹林胶囊和栓剂中辅料及降解产物的干扰 柱分配色谱-紫外分光光度法不需特殊仪器, 结果重现性较好, 但操作较繁琐2022/8/469三、高效液相色谱法阿司匹林栓的含量测定: 取本品5粒,

25、精密称定, 置小烧杯中, 在4050水浴上微温熔融, 在不断搅拌下冷却至室温, 精密称取适量(阿司匹林0.1g), 置50ml量瓶中, 加溶剂(1%冰醋酸的甲醇溶液)适量, 在4050水浴中充分振摇使阿司匹林溶解, 放冷, 用溶剂稀释至刻度, 摇匀, 置冰浴中冷却1小时, 取出, 迅速滤过, 取续滤液作为供试品贮备液; 精密量取供试品贮备液5ml, 置100ml量瓶中, 用溶剂稀释至刻度, 摇匀, 精密量取10l进样分析; 按外标法以峰面积计算 流动相中添加冰醋酸是为抑制阿司匹林的解离, 消除色谱峰拖尾; 同时, 流动相及供试液中的醋酸也可抑制阿司匹林的水解D为稀释体积(ml,D=50100/

26、5=1000);标示量为栓剂规格(mg/支) 2022/8/470两步滴定法测定阿司匹林片或阿司匹林肠溶片时，第一步滴定反应的作用是（ ） A消除共存酸性物质的干扰 B使阿司匹林反应完全 C便于观测终点 D有利于第二步滴定含量测定A2022/8/471含量测定B2022/8/472含量测定多选ACDE2022/8/473第五节 体内药物分析一、血浆中阿司匹林与水杨酸的HPLC测定法二、血浆中布洛芬的HPLC测定 与立体选择性代谢研究 2022/8/474一、血浆中阿司匹林与水杨酸测定ASA在体内迅速转化为活性代谢物(SA), 进一步转化为非活性代谢物水杨尿酸及葡糖醛酸结合物在进行阿司匹林药代动

27、力学研究时, 要求同时监测原形药物ASA和活性代谢物SA 质谱条件 离子化方式: 电喷雾(ESI)离子源, 负离子模式; 扫描方式: 多反应监测(MRM) ASA: m/z 178.9136.8 SA: m/z 136.992.8 4-ABS(内标物): m/z 162.9118.92022/8/475一、血浆中阿司匹林与水杨酸测定血浆样品处理: 血浆200l, 置1.5ml离心管中, 加1mol/L盐酸溶液50l和内标溶液200l, 混匀, 加入乙酸乙酯600l, 振荡1min, 离心(13 000 r/min)5min; 取上层清液, 吹干, 加流动相300l复溶, 取10l进样空白血浆与

28、定量下限QC样品色谱图2022/8/476一、血浆中阿司匹林与水杨酸测定结果与讨论 人血浆中阿司匹林和水杨酸线性范围 2510 000ng/ml(r0.990) 定量下限(LOQ)为25ng/ml 日内和日间精密度RSD15% 准确度RE15% 适用于阿司匹林的人体药代动力学研究2022/8/477二、布洛芬的立体选择性代谢 布洛芬(Ibuprofen, IBP)的左、右旋光异构体在体内的药理活性及代谢过程存在显著差异体外右旋体的药理作用是左旋体的160倍, 体内仅为1.4倍; 主要原因是在体内无活性的R-(-)-布洛芬部分转化为活性的S-(+)-布洛芬 色谱条件与洗脱程序 手性柱Chiralcel OJ-H柱(2504.6mm, 5m) 非手性柱SiO2柱(504.6mm, 5