细胞检测的研究

1、细胞检测方案汇报1HIV-抗体检测方法 （一）酶联免疫吸附测定法 采用双抗原夹心ELISA方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒HIV（1+2）型抗体，预包被高纯度基因重组HIV（1+2）型抗原，可与标本中的抗-HIV抗体反应，加入HRP标记HIV（1+2）型抗体抗原结合，形成抗原抗体酶标抗原复合物，然后加入TMB底物产生显色反应。通过酶标仪检测吸光度（OD值），根据OD值判断HIV抗体的存在与否。 2配液：将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至1000ml备用。编号：将样品对应微孔按序编号，每板设阴性对照2孔、阳性对照3孔，空白对照2孔。加样：分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳

2、性对照100l，用封板膜封板后置37温育60min。洗涤：小心把封板膜揭去，用洗板机选择5次程序，洗板后在干净纱布上拍干。加酶：每孔加酶结合物100l（空白对照孔除外），充分混匀，用封板膜封板后置37温育30min。洗涤：小心把封板膜揭去，用洗板机选择5次程序，洗板后在干净纱布上拍干。显色：每孔加入底物缓冲液50l，TMB 50l，轻轻振荡混匀，封板后置37避光显色10min。测定：每孔加终止液50l，轻轻振荡混匀。设定酶标仪波长为450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630 nm），空白调零，读取各孔OD值。3人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)型抗体诊断试剂盒试剂盒组成：、HIV酶标

3、板；、HIV酶标试剂；、HIV（1+2）型阳性及阴性对照血清；、显色剂A液和B液；、此外还有浓缩洗涤液、终止液、自封袋、封板膜、说明书等。4HIV-抗体检测方法（二）金标法检测 原理 利用双抗原夹心法检测HIV抗体。标本加入反应板，若标本中含有HIV抗体时，先与金标抗原反应，形成抗体-金标抗体复合物，在虹吸作用下向前移动，遇到包被抗原形成抗原-抗体-金标抗原复合物，并出现红色沉淀线。包被膜上同时带有一条质控包被线作为对照，所以当出现一条红色质控线和一条（或两条）红色反应线时判断为阳性。当待测标本中无HIV抗体时，只出现一条红色质控线则判断为阴性。作为质控，不管结果为阳性或阴性，都会出现一条红色

4、质控线。如无红色质控线（或只有反应线）出现，则实验无效。 5（1）、撕开包装有HIV-1+2抗体检测板的袋，取出检测板水平放置于实验台上。（2）、用塑料吸管吸2-3滴血清标本（70-100微升）加入标本孔中。（3）、15-30分钟内观察结果。10、结果判断（1）、阳性：出现两条或三条红线均为阳性反应。（2）、阴性：仅出现质控一条红线，则实验结果为阴性。（3）、无效：如无红线（或只有反应线）出现，表明实验无效，须重新检测。质量控制：阴性对照显示为阴性；阳性对照显示为阳性。6HBV-DNA荧光定量PCR检测采用PCR方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术，适用于检测人临床血清或血浆样本中的乙型肝炎病

5、毒DNA 仪器：Fluo Cycle型核酸扩增荧光检测仪为上海科华实验系统有限公司产品。HBV-DNA荧光定量试剂盒采用上海科华生物工程股份有限公司产品。 荧光探针实时检测定量PCR方法。从血清中提取HBV-DNA将其加入反应管，放入扩增仪进行扩增，反应结束后由电脑自动分析结果。7EBV-DNA荧光定量PCR检测 简单介绍 EB病毒（EBV）是在研究非洲儿童淋巴瘤（BL）时，从瘤细胞培养中发现的一种病毒，时传染性单核细胞增多症的病源，并与BL和鼻咽癌有关。仪器试剂： EBV-DNA 荧光检测试剂盒 Fluo Cycle型核酸扩增荧光检测仪EBV-DNA 荧光检测试剂盒8CMV的检测方法 巨细胞

6、病毒感染是先天性感染疾病的最常见的病因，能引起胎儿、婴儿严重损害，甚至死亡。尤其重要的是导致中枢神经系统的后遗症 常用方法有：（1）酶联免疫吸附试验检测孕妇血清巨细胞病毒IgG、IgM；（2）孕妇宫颈脱落细胞或尿液涂片行Giemsa染色后，（3）DNA分子杂交技术检测巨细胞病毒DNA， （4）PCR技术扩增巨细胞病毒DNA，短时间内获满意结果。 9血清巨细胞病毒IgG、IgM 采用酶联免疫间接法原理定性检测人血清中的人类巨细胞病毒IgG抗体（HCMV-IgG），以纯化人类巨细胞病毒抗原包被酶联板。待检血清中的人类巨细胞病毒与包被抗原反应，再与酶标记抗人IgG抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复

7、合物。加底物TMB显色，在酶标仪上比色后根据吸光度（A值）判定有无人类巨细胞病毒IgG抗体的存在。基本仪器：酶标仪 洗板机10上海科华酶标仪11上海科华洗板机12乙肝表面抗原定量（HBSAg）酶联免疫吸附实验 设备和材料 酶标仪: KHB ST-360 洗板机: KHB ST-36W 精确移液器:单通道可调移液器40-200ul一支 高品质蒸馏水乙型肝炎病毒抗原（HBSAg）诊断试剂盒 13乙型肝炎病毒抗原（HBSAg）诊断试剂盒14（三）.操作流程1.每孔加入待测标本50ul，设阴阳性对照各两孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各1滴，并设空白对照1孔，质控1孔2.每孔加入酶结合物1滴（空白对

8、照孔除外），充分混匀,置37孵育30分钟，洗板机洗板后扣干。3.每孔加显色剂A液B液各1滴，充分混匀，置37孵育15分钟。4.每孔加入终止液1滴，充分混匀。5.用酶标仪读数，取波长450/630nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。（四）结果判定 样品OD值阴性对照平均OD值2.1 判断为阳性,否则为阴性阴性对照OD值低于0.05作0.05计算,高于0.05按实际OD值计算 15乙肝核心抗体定性（HBcAb）酶联免疫吸附实验 方法原理 采用ELISA竞争法，反应板的琼脂微孔包被基因工程重组HBcAb，加入待测血液，同时单克隆抗-HBc-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测标本中抗-HBc含量

9、高，则抗-HBc-HRP与HBcAg结合少，加入底物TMB时显色淡，反之则显色深。 16乙肝表面抗体定性（HBsAb）酶联免疫吸附实验方法原理 采用ELISA双抗原夹心法，反应板的琼脂微孔包被纯化HBsAg,待测血液中抗HBs抗体与之反应，再加HRP标记HBsAg形成HBsAg-抗HBs抗体-HRP标记HBsAg复合物，最后加底物TMB显色。17乙型肝炎e 抗体定性检测 采用ELISA竞争法，反应板的琼脂微孔包被基因工程重组HBeAg，加入待测血液，同时单克隆抗-HBe-HRP，与抗原形成竞争结合，如待测标本中抗-HBe含量高，则抗-HBe-HRP与HBeAg结合少，加入底物TMB时显色淡，反

10、之则显色深。1、分析仪器：为美国BIO-RAD公司提供的MODEL550型酶标仪，仪器校准请参见仪器操作规程。 2、分析试剂：为上海科华公司提供的配套的HBsAb试剂盒，规格为96test/盒，2-8贮存，有效期12个月；在效期内使用试剂。 3、质控试剂：为上海公司提供的配套的HBsAb试剂盒中所附带的阴、阳性对照，2-8贮存，有效期12个月每月一次质控小结，失控要有记录及纠正的结果。18操作方法 1、每孔加入待测标本50微升。2、每孔加入酶结合物1滴，充分混匀，封板，置37孵育30分钟。3、手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。洗板机洗板：选择洗涤5次程序洗

11、板后拍干。4、每孔加显色剂A液、B液各1滴，充分混匀，封板，置37孵育才1分钟。5每孔加入终止液1滴，混匀。 6、用酶标仪读数，数值取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm），先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。19乙型肝炎e抗原定性检测 方法原理采用ELISA双抗体夹心法，反应板的琼脂微孔包被抗HBe抗体,待测血液中乙型肝炎病毒e抗原与之反应，再加HRP标记HBeAb 形成抗HBe抗体-HBeAg- HRP标记HBeAb复合物，最后加底物TMB显色。20血清丙氨酸转移酶的测定仪器 ：VITROS950全自动生化分析仪， TORBOS特定蛋白分析仪。试剂： ALT和Ch

12、E测定采用原装试剂 PA测定采用PA测定试剂盒。方法 ：严格按照仪器和试剂规定要求保养仪器和设定测定参数。测定标本时，每批同时测定质控品，按Westgard质控评价方法评价质控结果，质控结果在控，测定批测定结果有效。21血清总蛋白的测定试验方法：双缩脲法仪器 ： 全自动生化仪;半自动生化仪;加样移液器试剂 ：（1） 6mol/L NaOH溶液和6mol/L KOH溶液按常规方法配制。（2）双缩脲试剂 按Doumas配方 称取未失结晶水的硫酸铜（CuSO 4 5H 2 O）3.0g，溶于500m1新鲜蒸馏水中，加酒石酸钾钠（NaKC 4 H 4 O 6 4H 2 O）9.0g，碘化钾（KI）5.

13、0g，待安全溶解后，加入6mol/L氢氧化钠溶液100ml，最后加蒸馏水至1L。室温贮存在密闭的聚乙烯瓶里，约稳定6个月。（3）双缩脲空白试剂 除不含硫酸铜外，其余成分与双缩 脲试剂相同。22（4） 改良双缩脲双试剂 R1:取10ml6mol/L KOH溶液，加水稀释至100ml，另加表面活性剂-聚乙二醇基苯基醚（Trition X-100）50l。R2:浓缩5倍的双缩脲试剂。即称取CuSO 4 5H 2 O3g溶于新鲜制备的蒸馏水中，加入酒石酸钾钠9g和KI5g，待完全溶解后，在搅拌下加入6mol/L KOH溶液20ml，并用蒸馏水稀释至200ml。双缩脲法手工标化测定 ： 测定管（M）、标

14、准管（S）、试剂空白管（RB），分别加入血清、蛋白标准、蒸馏水各50l加双缩脲试剂5.00ml;另取标本空白管（B）加入双缩脲空白试剂及血清50l，混匀置（251）30min，之后各管加3.00ml乙醚抽提，在波长546nm处比色，用蒸馏水调零，测各管吸光度。计算:血清总蛋白（g/L）=AM-ARB-AB/AS-ARB-AB标准浓度23溴甲酚紫法测定血清白蛋白1.1 仪器与试剂 BECKMAN CX5型全自动生化分析仪、美国BECKMAN ALB试剂（批号442765）;ALB标准品采用英国RANDOX Calibrator（批号CAL2350）;质控品采用英国RANDOX（批号226UE）和

15、BECKMAN Decision Level3（批号008003）。 全自动生化分析仪24 1.2 原理 在pH4.9醋酸盐缓冲液中，溴甲酚紫与白蛋白结合形成绿色复合物，在600nm波长处的吸光度与白蛋白浓度成正比，与同样处理的白蛋白标准比较，可计算样品血清中的白蛋白浓度。1.3 方法 取RANDOX Calibrator的中间水平42g/L作标准，以两管去离子水作为0g/L的标准对CX5进行假三点定标，随后测定83g/L、72.63g/L、62.25g/L、55.33g/L、42g/L、28g/L、21g/L、14g/L、10.5g/L、5.0g/L共10个浓度的ALB标准溶液及其吸光度，制

16、作标准曲线;收集30ml新鲜混合血清用CX5进行批内和批间精密度试验。另收集100份门诊就诊者血清，用System Calibrator对CX5的ALB进行定标后，生化分析仪进行ALB检测。 25血清总胆红素(T-Bil)试剂盒检验仪器：半自动生化分析仪（SECOMAM公司生产，型号：BASIC）；试剂：总胆红素测定试剂盒；总胆红素标准液；多项液体生化质控血清等。实验原理重氮法：总胆红素在二甲亚砜等加速剂作用下，在酸性溶液中与重氮苯磺酸作用生成紫色的偶氮胆红素，与经过同样处理的标准液比较，即可计算出样品中胆红素的含量。26甲型肝炎病毒IgM抗体(HAV-IgM) 采用双抗原夹心酶联免疫法（EL

17、ISA）测定标本中人甲型肝炎病毒IgM抗体(HAV-IgM)。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中甲型肝炎病毒IgM抗体(HAV-IgM)相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人甲型肝炎病毒IgM抗体(HAV-IgM)的存在与否。27样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

18、仔细收集上清，保存过如中如出现沉淀，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，

19、以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20保存，但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物

20、酶的（HRP）活性。28 编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）2. 加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50l。然后在待测样品孔先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，3. 温育：用封板膜封板后置37温育30分钟。 4. 配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔

21、除外。 7. 温育：操作同3。8. 洗涤：操作同5。9. 显色：每孔先加入显色剂A 50l，再加入显色剂B 50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15分钟10. 终止：每孔加终止液50l，终止反应（此时蓝色立转黄色）。11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以 29结果判定： 试验有效性：阳性对照孔平均值1.00; 阴性对照平均值0.10 临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15 阴性判定：样品OD值 临界值（CUT OFF）者为甲型肝炎病毒IgM抗体(HAV-IgM)阴性 阳性判定：样品OD值 临界值（CUT

22、OFF）者为甲型肝炎病毒IgM抗体(HAV-IgM)阳性30注意事项1操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。2试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。3浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。4 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。5底物请避光保存。6试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为630nm7所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。31丙型肝炎病毒IgM抗体(HCV-IgM)一.目的：用于HCV抗体酶联

23、的测定。二.适用范围：适用于HCV酶联免疫检测法，手工操作。三.支持性文件：酶联免疫检测法试剂盒操作说明书。四.原理：酶联免疫（ELISA）法。五.仪器：伯乐550酶标仪，伯乐ELX-50洗板机。六.试剂：购买英科新创试剂。规格为1*96Test。试剂文号：（93）卫药试字（厦新创）S-01 号。32梅毒检测梅毒甲苯胺红不加热血清试验 实验原理采用性病实验室玻片试验抗原（VDRL抗原），重悬于特制的甲苯胺红溶液中，当待测血清中存在反应素时。能与VDRL抗原发生凝集反应，出现肉眼可见的粉红色凝块。33解脲支原体检测Uu 的检测方法主要有：培养法：原理是Uu能分解尿素产氨，使含酚红指示剂的Uu液体

24、培养液pH值上升，颜色由黄色变为红色。再将液体培养物转种到Uu固体培养基上，能生长成具特征性油煎蛋样集落。接种标本后，经孵育，若培养基发生由黄变红的颜色变化，透明无混浊（有别于某些细菌及真菌生长）则可初步判断为有Uu生长。大多数Uu在培养24h内可获得阳性结果。如果培养基发生颜色变化，但液体又有混浊，可用0.45m滤膜过滤后，作再接种观察。进一步诊断需将液体培养物接种到固体培养基上培养, 经Dienes法染色后在低倍显微镜下观察集落形态。阴性结果最好观察天。UU在固体培养基上集落核心呈粗颗粒状,具极窄的边，有时呈油煎蛋样。如用 Dienes 法染色，集落为特异的蓝色。一般细菌的菌落不着色，容易

25、鉴别。 ) 34未污染的细胞支原体污染的细胞电镜检测35丙肝RNA的检测定性HCV RNA检测。采用逆转录PCR技术定量目标基因扩增法，包括PCR定时检查和信号扩增法，商品化的试剂盒Roche检测法是标准化的PCR定量检测，能检测的HCV最小数量为每毫升小于1000个拷贝。同一个标本进行重复检测时，标准差为0311，可信度为95。可以进行HCV基因型的检查。其准确性和精确程度远远优于HCVRNA定性检测。36单纯疱疹病毒型IgM抗体检测（酶联免疫法）【试验原理】本试剂盒采用捕获法原理检测人血清或血浆样品中风疹病毒IgM抗体（RV-IgM），微孔中预包被抗人-IgM（U-链），首先加入待测标本的

26、血清或血浆样品后，样品中的IgM抗体都可被捕获，未结合的其他成分（包括特异的IgG抗体）被洗涤除去，第二步，加入RV抗原酶标记物，被捕获的IgM中的RV-IgM会与来更过氧化物酶标记的RV重组抗原特异性的结合，洗去其它未结合物，做好用TMB底物显色。通过酶标仪检测吸光度（A值）从而判定样品中的RV-IgM抗体的存在与否。37【试剂盒储存条件】 于2-8避光保存，防止冷冻；请将拆封后未用完全的包被板放入自封袋内封紧保存于2-8。 有效期：自检定合格之日起在2-8条件下有效期12个月；打开包装后包被板载2-8条件下有效期30天。【使用仪器及所需材料】 蒸馏水或去离子水 一次性手套和定时器 吸水纸

27、25ml、100ml、1000ml可度量筒 酶免自动仪器或者手持单道/多道移液器 适用于盛放污物的容器 温箱或水浴箱 手用于混合微孔内液体的震荡器 全自动、半自动或手工洗板系统 酶标仪，单波长450nm或双波长450nm和630nm38内毒素检测（动态浊度法）【检验原理】利用鲎试剂凝固酶原被微量细菌内毒素激活产生浊度或凝胶反应的机理，以反应物浊度达到某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，分别对细菌内毒素浓度和反应时间取对数，用最小二乘法做线性回归（Lgt=a+blgc）得到反应曲线，计算反应物中的内毒素含量，实现对样本溶液的细菌内毒素定量检测。39结果判断上图：阳性下图：阴性40【适用仪器】B

28、ET-24A型细菌内毒素测定仪。【标准曲线】使用试剂盒时，如反应主剂鲎试剂的批号改变，应向供应商索取该批号反应主剂的标准曲线IC卡；或用细菌内毒素标准品制作标准曲线，标准曲线制作方法（略）。【样本要求】1.建议空腹采集血液样本。 2.采集血液样本时，应避免在输、注药液的同部位采血。【检验方法】见产品使用说明书。【产品性能指标】检测范围：0.005 EU/ml100EU/ml；相关系数： r 0.98；批内精密度：变异系数15%。 【参考文献】中国药典附录细菌内毒素检查法（光度法）41鲎试剂检测试剂盒42细菌及真菌的检测直接接种法薄膜过滤法43细菌及真菌的检测培养基： 检查需氧性和厌氧性杂菌应采用硫乙醇酸盐培养基。 检查霉菌和腐生菌应采用改良马丁培养基。 检查混浊制品可采用不含琼脂的硫乙醇酸盐培养基。检查活菌苗时可加大琼脂含量，做成斜面。检查支原体应采用猪胃消化液半固体或牛心消化液半固体培