64生物化学方法及其在中医研究中的应用-6

1、.：.；第六章 第四节 生物化学方法及其在中医研讨中的运用一生物化学的主要实验方法有哪些？答题要点：一生物大分子物质的分别和提纯生物大分子主要指蛋白质、核酸、糖类和脂类等物质。制备高度纯化的生物大分子是研讨大分子构造与功能的前提，整个分别提纯过程可分为以下几个阶段： 1资料选择。原那么是：选取所需成分含量较高、来源丰富、工艺简单、本钱低廉的资料。例如，胰岛素的提取可选择猪胰。还要留意取材新颖，要进展预处置，对于蛋白质和核酸的提取要在低温条件下进展，防止生物大分子的变性、失活。 2细胞破碎。生物大分子绝大部分存在于细胞内。根据资料来源及实验要求，可选取匀浆器研磨、高速组织捣碎器、反复冻融、超声波

2、破碎、自溶、酶消化、外表活性剂处置法等。 3亚细胞器的分别。各类生物大分子在细胞内分布往往是区域化的。例，DNA几乎全部在细胞核中，电子传送链和氧化磷酸化酶系分布在线粒体，蛋白质合成酶系在内质网微粒体上，Na+-K+-ATP酶分布在细胞膜上等，因此细胞破碎后，可以先分别亚细胞器，这有助于制备纯度更高的生物大分子。亚细胞器的分别，普通采用不同密度梯度介质，经差速离心法制备。 4提取。提取过程，首先要使生物大分子与其他物质别分开来，使大分子物质充分释放出来，在此过程中，特别要思索溶剂性质、pH值、离子强度、介电常数、抽提温度等多种影响溶解度的要素，然后可结合阅历并根据详细实验条件灵敏地选取某一试剂

3、进展提取。 5分别纯化。刚提获得到的大分子物质，往往是粗制品，含有许多杂质，必需进一步分别纯化。分别提纯各种生物大分子，主要根据各种物质的分子大小、溶解度、带电性、亲和力大小等差别，选用有机溶剂沉淀，等电点沉淀，盐析，层析，电泳，超离心，吸附，结晶等方法。 6浓缩、枯燥及保管。经过分别、纯化得到的提取液有时很稀，体积较大，需求采用蒸馏法、冰冻法、吸收法、超滤法等，去除水分而浓缩。最后低温保管，有时还需参与防腐剂或稳定剂，防止生物大分子变性失活。二离心技术离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒到达浓缩或与其他颗粒分别之目的。这里的悬浮

4、颗粒往往是指制成悬浮形状的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒分开轴心方向挪动，发生沉降；假设颗粒密度低于周围介质的密度时，那么颗粒朝向轴心方向挪动而发生漂浮。常用的离心机有多种类型，普通低速离心机的最高转速不超越6000rpm，高速离心机在25000rpm以下，超速离心机的最高速度达30000rpm以上。根据离心原理，可设计多种离心方法，常见以下三大类型： 1差速离心法。经过逐渐添加相对离心力，使一个非均相混合液内外形不同的大小颗粒分步沉淀。 2密度梯度离心法。离心前，离心管内先装入分别介质如蔗糖、甘油等，使构成延续的或不延续的密度梯

5、度介质，然后参与样品进展离心，详细又可分为： 1速度区带离心法。离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，待分别样品铺在梯度液的顶部，离心管底部或梯度层中间，同梯度液一同离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，到达彼此分别的目的。本法可分别各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。 2预制梯度等密度离心法。要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分别样品普通铺在梯度液顶上，如需挟在梯度液中间或管底部，那么需调理样品液密度。离心后，不同

6、密度的样品颗粒到达与本身密度相等的梯度层，即到达等密度的位置而获得分别。 3自成梯度等密度离心法。某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速构成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需求离心分别的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开场后，梯度介质由于离心力的作用逐渐构成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与其本身密度相等的梯度层里，即到达等密度的位置而获得分别。 3沉降平衡离心法。根据被分别物质的浮力密度差别进展分别，所用的介质起始密度约等于被分别物质的密度，介质在离心过程中构成密度梯度，被分

7、别物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并构成区带。三层析技术层析法又称色谱法，是目前广泛运用的一类分别分析技术。它是利用混合物各组分理化性质上的差别，例如吸附力、溶解度、分配系数、带电性、分子大小、亲和力等，使各组分以不同程度分布在二个相中，其中一个为固定相，另一个为流动相，当混合物随流动相经过固定相时，由于各组分受固定相的阻力和流动相的推力不同，而使各组分挪动速度各异，以到达分别的目的。主要有： 1根据分别的原理可划分为： 1吸附层析。是利用混合物随流动相经过由吸附剂组成的固定相时，因吸附剂对各组分的吸附才干的不同，而使各组分流动速度不同，将各组分分别。吸附层析根据支持物装填方式的

8、不同有柱层析和薄层层析类，前者常用于分别非极性或极性较小的有机物，后者用于分别氨基酸、类固醇激素等。 2分配层析。利用混合物随流动相非极性溶剂经过含极性溶剂的载体组成的固定相时，由于各组分在二相中的分配系数的不同，而使混合物各组分在两相间发生不同的分配景象而逐渐分开。分配层析运用最广泛的是纸层析。 3离子交换层析。离子交换层析是利用离子交换剂作为固定相，离子交换剂是一类具有酸性或碱性基团，能与溶液中的阳离子或阴离子发生交换的不溶性物质，流动相通常是具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。将混合溶液参与离子交换柱，由于离子交换剂对混合液中各种离子具有不同的亲和力而产生不同的吸附作用，当流动相流

9、经离子交换柱时，可以降低离子交换剂对吸附离子的亲和力而被交换洗脱下来，从而到达分别的目的。 4凝胶层析。以多孔性网状构造的凝胶葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶等为固定相装柱，将分子量大小不同的混合组分参与柱，用一种洗脱液作为流动相进展洗脱。小分子物质易进入凝胶颗粒内部使流程延伸，大分子物质不能进入凝胶颗粒内而被排阻在外，流程较短，经过一定洗脱时间后，可将混合物按分子大小不同别分开来。 5亲和层析。亲和层析是根据生物大分子与其配基之间具有高度专注性的亲和力而设计的一种层析技术。具有专注亲和力的生物分子对主要有：酶与底物包括辅酶与辅基、激素与受体、抗原与抗体、DNA与RNA、凝集素与糖蛋白等

10、，由于结合双方是互配的，因此分子对任何一方均可作为配基，经过化学法衔接到载体上作为固定相装柱，将欲分别的混合物分子对另一方参与柱，由于分子对双方有高度亲和力而被吸附结合在柱上，其它杂质首先随流动相被洗脱下来，然后改动流动相成分，将吸附结合在柱上的亲合分子洗脱下来。 2根据两相物理形状可划分为： 1液相层析。流动相为液体的层析，如上述各种层析。 2气相层析。流动相为气体的层析。固定相有固体或液体，故又分作气固层析或气液层析。 3根据支持物的装填方式可划分为：柱层析将支持物装在管子中成柱形，在柱中进展层析，薄层层析支持物铺在玻璃板上成一薄层，在薄层上进展层析，纸层析用纸做支持物的层析。四电泳技术带

11、电颗粒在电场作用下，向着其电性相反方向挪动的景象称为电泳。由于被分别物质各自的带电性、带电量、分子颗粒大小和外形等的不同，在同一电埸下它们的挪动速度各异，经过一定时间电泳后可被别分开来。在电泳过程中，带电颗粒的迁移率在一定条件下与其所带电量、颗粒半径和溶液的粘度相关。此外还有以下要素可以影响物质的电泳迁移率：电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度、电渗作用等。 目前采用的电泳大致有三大类：显微电泳、自在界面电泳和区带电泳。其中区带电泳运用较为广泛。所谓区带电泳是指在电埸作用下，被分别的各组分在支持物上相互分别为不同的区带。分类如下： 1按支持物的物理性状不同可分为：1滤纸及其他纤维纸电泳，2粉

12、末电泳，3凝胶电泳、4缘线电泳。 2按支持物的安装方式不同可分为：1平板式电泳，2垂直板式电泳，3垂直柱式电泳，4延续液动电泳。 3按pH的延续性不同可分为：1延续pH电泳，2非延续pH电泳。五光谱技术 光谱技术是利用各种化学物质所具有的发射、吸收或散射辅射能的特性，对物质进展定性或定量的一类分析技术。它具有灵敏度高，测定简便、快速，试样不被破坏等优点，是一类最常用的生化测定技术。 1比色分析法 比色法是利用有色物质对一定波长的光的吸收特性来进展定量的一种分析方法。在一定浓度范围内，溶液中有色物质的浓度与溶液颜色的深度成正比，用可见光400-760nm作光源，比较溶液的颜色深浅度以测定所含有色

13、物质浓度的方法，叫做比色法。常用的有： 1规范对照法。将样品和规范样品溶液在一样条件下分别测定它们的吸光度，计算出试样溶液的浓度。 2规范曲线法。配制一系列浓度不同的规范品溶液，按一定操作方法显色，在选定波长条件下分别测定它们的吸光度，以吸光度为纵坐标，规范溶液的浓度为横坐标，作一条规范曲线或任务曲线。以后只需在一样条件下实验，测定未知样品溶液的吸光度，从规范曲线上求得相对应的浓度值，即为未知样品液的浓度，一条规范曲线，如测定条件不变，可供多次运用，否那么应重新绘制。 2分光光度法 分光光度是根据被测物质对各种波长光的吸收才干吸光度或光密度，绘制吸收光谱曲线，不同的物质，分子构造不同，其吸收曲

14、线各有特殊方式，根据曲线的特征，用于物质的定性定量。分光光度法波长范围较大(200-1000nm)，因此，既可用于可见光，也可用于紫外光和红外光的分光测定，故测定物质既可是有色物，也可是无色物，扩展了运用范围。由于分光光法采用单色光器棱镜，得到单色光，其波长范围比滤光片波长更狭窄，提高了分析的灵敏度、准确度和选择性。所用的仪器721分光光度计、752紫外分光光度计等。 3荧光光度 某些物质经紫外光照射能发出比原激发光的频率低，波长长的可见光，这种光称为荧光。各种物质经紫外光激发后能发出的荧光特性与物质的化学性有关。在激发光强度和所经过的溶液厚度不变时，在一定浓度范围内该物质所产生的荧光强度与其

15、浓度成正比。因此，可以用知浓度的规范与待测样品同样操作，经过测定荧光强度F，按前述的规范曲线法和规范对照法，求得待测物质的浓度。所用的仪器如国产930型、910型等荧光光度计。 4比浊法 比浊法是利用混悬溶液中颗粒对光线产生散射特性进展测定。其测定的实际、方法和计算等类似于比色分析法，因此根本上任何一种光电比色计或分光光度计都能用于比浊测定。六分子杂交技术详见第八节二心气虚证血清SOD活性、血清LPO含量和血浆内核酸含量的变化怎样？其意义如何？答题要点：1心气虚证患者红细胞SOD活性明显下降，而血清LPO含量那么显著升高，推测由于红细胞SOD活性下降不能维护心肌免受超氧自在基的攻击，以致产生心

16、气虚的临床病症。2心气虚患者血浆核酸总量及DNA、RNA含量均低于正常对照组，提示心气虚患者蛋白质合胜利能有一定的妨碍。三试述脾虚证主要的物质代谢异常表现。答题要点：1用柠檬酸刺激前后唾液淀粉酶活性和唾液流量的变化，结果发现正常人酸刺激前后唾液淀粉酶活性多上升，而脾虚病人那么酶活性下降，提示脾虚病人腮腺细胞对外源性刺激的反响性降低，这能够是脾虚病人的虚象的表现。血清胃泌素和胰淀粉酶活性低下，胃肠蠕动紊乱，小肠吸收功能低下。阐明脾虚患者的胃肠功能确有紊乱。脾虚患者木糖排泄率较正常人显著降低。脾虚证的食少、腹胀满、大便不调、神疲气短四大主症的分级量比值与木糖排泄率下降有一致性的规律。血清淀粉酶及其

17、同功酶和胰脂肪酶均显著下降，且脾气虚的三个主症食欲减退、食后腹胀与大便溏泄与胰淀粉酶活性同功酶活性降低呈正相关，脾气虚的胰淀粉酶活性和胰脂肪酶活性与对照组之间有显著性差别，阐明胰腺外分泌功能的降低可视为脾气虚证的特异性诊断目的之一，且淀粉酶总活性的降低取决于胰淀粉酶同功酶的下降，而与唾液淀粉酶无关，为脾气虚证诊断提供了一个更准确有效的实验目的。5血清必需脂肪酸检测：血清花生四烯酸减少，与亚油酸比值也下降，甘油三酯TG增高，总胆固醇TC增高，高密度脂蛋白胆固醇HDL-C比值下降。脾气虚证、脾阳虚证、脾阴虚证模型的血清脂质过氧化物LPO明显升高，抗氧化酶活性下降。血清丙二醛MDA含量升高，其中以脾

18、肾两虚型的MDA含量最高。6血清游离氨基酸FAA、必需氨基酸、支链氨基酸明显降低，缬、甘、苏、色、异亮、丝、丙、组氨酸等8种氨基酸含量也明显降低；FAA含量、必需氨基酸、支链氨基酸含量及木糖吸收率之间、FAA总量与血清总蛋白、白蛋白、淋转率、补体C3之间和支链氨基酸与白蛋白之间均显著正相关，提示脾气虚患者血清FAA含量降低与肠道吸收不良、血清蛋白浓度和免疫功能低下有关。 四试述肾虚证物质代谢异常的主要表现。答题要点：老年肾虚证患者血清过氧化脂质LPO含量明显高于老年安康组。脂褐素LPF含量增高，超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶活性以及铜蓝蛋白含量降低。血清铁、锌含量下降。五试述脾虚证能量代谢异

19、常的主要表现。答题要点：1肌酸磷酸激酶CPK、琥珀酸脱氢酶、辅酶1-四氮唑复原酶NADH-TR活性、肌球蛋白腺苷三磷酸酶M-ATPase活性降低，肌糖原含量减少，线粒体发生改动，骨骼肌有氧氧化效率降低，糖酵解供能途径妨碍，能量代谢受阻；CPK和肌型肌酸磷酸激酶CPK-MM活性的降低与脾气虚的轻重程度有量的相关性。2骨骼肌细胞ATP含量和能荷值显著减小，与无氧酵解相关的乳酸脱氢酶LDH以及有氧氧化相关的琥珀酸脱氢酶SDH活性显著升高，提示能量代谢异常，与之相关的微量元素锌和铁含量也相应升高，而与肌肉收缩有关的元素铜、砷、钠减少而钙增多。红细胞膜Na+-K+-ATPase活性也显著低于正常组。六心

20、气阴虚证神经内分泌异常表现有哪些？答题要点：1心气虚、肺气虚和心肺气虚患者血浆心钠素含量显著降低，而心阴虚、肺阴虚和肝肾阴虚患者血浆心钠素含量那么升高。2心阴虚证存在左心功能低下和心血管植物神经功能紊乱，多与高血压、心功能不全及交感肾上腺能神经偏亢有关。心功能不全，激活了肾素-血管紧张素-醛固酮系统RAAS，从而添加了外周阻力。心阴虚患者红细胞电泳时间明显缩短，血糖含量较正常组高，糖耐量降低，并发现该证患者血浆雌二醇E2、睾酮T含量低于正常人。七脾虚证神经内分泌异常表现有哪些？答题要点：1血清乙酰胆碱程度明显升高，胆碱酯酶活性明显下降，阐明脾气虚证患者副交感神经系统处于兴奋形状。2血、尿PGE

21、2 、PGF2含量及其与中医证型的关系：脾气虚组、肝胃不和组和脾胃湿热组PGE2程度均明显高于对照组，其中以脾胃湿热组升高最明显，而且明显高于脾气虚证和肝胃不和组，PGE2/PGF2比值，脾胃湿热组也明显高于对照组、脾气虚证和肝胃不和组，三组证型的尿与血中PG程度有类似的变化，能够是与血中PG经代谢灭活后从尿中排泄有关。上述结果初步阐明，PG程度变化对脾气虚证并非特异，但提示了脾气虚证构成过程中有PGE2参与调理。脾虚患者胃粘膜PGE2、PGI2的代谢产物6-酮-前列腺素F16-Keto-PGF1、血栓素A2TXA2的代谢产物血栓素B2TXB2含量之比值及环核苷酸cAMP含量均明显低于对照组，

22、且胃粘膜PGE2、6-Keto-PGF1与cAMP呈正相关。3血浆cAMP含量明显降低，交感神经系统功能低下，副交感神经系统功能相对亢进，脾阴虚证，包括消化道疾病、甲亢、多种癌手术后和夏季热等，其血浆cAMP降低，cGMP升高，变化趋势与脾气虚相近。4脾虚证胃窦粘膜中D细胞数明显减少，D细胞分泌的生长激素有抑制胃泌素、胃酸和胃蛋白酶原分泌的作用，推测D细胞减少系脾虚证患者的一个重要病理形状学标志。大鼠脾虚证的血浆、胃窦及空肠组织中生长抑素SS含量均较正常对照组升高。脾气虚证患者血清中胃泌素程度降低，胃排空时间延迟，健脾益气药能添加胃泌素的分泌。5急腹症与腹部手术后脾虚证患者血清T3程度显著低下，rT3明显增高，T3/ rT3比值减小。八肾虚证神经内分泌有何异常表现？一下丘脑-垂体-性腺轴与肾虚 1肾阳虚患者性腺轴调理功能呈现一定程度的紊乱。肾阴虚者促卵泡素FSH偏低较多，肾阳虚者雌二醇升高，睾酮偏低较多，部分患者黄体生成素亦有明显变化，阐明肾阴虚与肾阳虚之间的激素程度有明显差别；肾阴、阳俱虚那么FSH、LH和T均低下。2肾虚者的血