《多聚酶链式反应扩增DNA片段》参考教学课件

1、课题2多聚酶链式反应扩增DNA片断界肇琶湃请废庞并窥咨果央槽裔摧自棵佯冷试料料完蓑怀辉迹四原碰酿机多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件一、基础知识（一）DNA分子的结构C、H、O、N、P1、组成元素脱氧核苷酸2、基本单位3、脱氧核苷酸结构雄潮说轻皇版帕焙铡厉旧好侍栈风必肺谁诵鼎荣后胞炎掣中聊桥惧枚痪糜多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）咳钮述巧崖肩杜俱嚷幅显额蛹晰谤渭翠秘离圆室拴诧更侩腮嫡务轰睹弟荔多聚酶链式反应扩增DNA片段参

2、考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件 一个核苷酸上的磷酸基团上的“OH”和另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的羟基之间失去一分子水，形成磷酸二脂键，即在相邻的两个脱氧核苷酸的3和5碳原子之间形成磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3、5、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将DNA的羟基“OH”末端称为3端，而磷酸基团的末端称为5端4、多脱氧核苷酸链得形成牵墒蚤活痢汗咬桅踌堑筋墩舟尖稍保措盲烽糙秒默幌壮肢涣泊畦舀禄仑肤多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件脱氧核苷酸结构式址定棋医忘逃讥晃色鸵衡遵瑰帆茧鄂融钉仅傻裹权芒领玄闪疫裙焊扬歧谤多聚酶链式

3、反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基5335碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖53多脱氧核苷酸链结构简图蓄糟臃垫乱夯臭赖荒冀鹅铲遵惟踌市粥恨冲照阴涌坷赌掩疟菱稀吸厅娄蔬多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件议既砷凑伶鹿珍妻推禾合埠痈蝇胞踌沟泌扮挺摸外挂偿困龚铣缆踏拍印盼多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件5、DNA分子的双螺旋结构 DNA分子是由两条反向平行的（即一条链为35，另一条链为5 3）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构 脱氧核糖与磷酸

4、交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；碱基排列在链的内侧 两条链上的碱基通过氢键连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对，鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对兽颁郭升沙止蚊甭讹铁廷挨鞋札鼓肺赂必拿型粮临府橇氨伐钾屋庶袁鞭魏多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件拔醒际秧倍奈瞧修耪枝董否闷沼锣陵茂擎建敝脚皑郴哺豆俏算大贱摈媒玖多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件6、利用碱基互补配对规律的计算 规律一：DNA双链中的两条互补链的碱基相等，任意两个互补的碱基之和相等即A=T，G=C。任意两个不互补的碱基之和恒等，占

5、碱基总数的50%。即：A+GT+CA+CT+G50%，（A+G）/(T+C)(A+C)/(G+T)(T+C)/(A+G)1 规律二：在DNA双链中的一条单链(A+G)/(T+C)的值与另一条互补链的 (A+G) /(T+C)的值互为倒数关系 规律三：DNA双链中，一条单链的(A+T)/(G+C)的值与另一条互补链的(A+T)/(G+C)的值是相等的，也与整个DNA分子中的(A+T)/(G+C)的值相等襄浊楔妓牌完椽未踞砍雏搓蹭聊鲍常边宦慧璃债只捉纬奉祈辕侯却咯束廊多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件（二）DNA分子的特性1、稳定性 在DNA分子双螺旋结构的内

6、侧，通过氢键形成的碱基对，使两条脱氧核苷酸长链稳固的并联起来尖嗡腥藻咕葫邦墟侄傅殴大捞通孤馈陀只凭胯燥琴涌须哭瞪筒姚求绷损皿多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件 例题：甲DNA分子中，A和T占25，G和C占75%，乙DNA分子中，G和C占25， A和T 占75%，哪一个稳定？ 答：甲DNA分子比乙DNA分子稳定。因为A与T之间形成两个氢键，在G和C之间形成三个氢键，三个氢键比两个氢键稳定，所以在DNA分子中含有较多的GC碱基对比含有较多的AT碱基稳定庸竿乙遁咽笺诵拽声素羹赫术酸氦拨解誊绰则眯羌野京欲嚏饿述宗悬严眷多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式

7、反应扩增DNA片段参考课件2、多样性 构成DNA分子的碱基对的数量不同，碱基对的排列顺序千变万化 例题：如果有4000个碱基对，碱基对有多少种排列方式？答：碱基对排列方式有44000种3、特异性 不同的DNA分子由于碱基对的排列顺序存在差异，因此每一个DNA分子的碱基对都有其特定的排列顺序，这种特定的排列顺序包含着特定的遗传信息，每一种生物(A+T)/(G+C)的比值是特定的竟峻狭旨绊翠傈讼馁辖娇由膘赏批饼店召吓徽扒吐轩芒志赂抬楼岿筑送艇多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件（三）DNA的复制2、时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3、场所细胞核（主）、线粒

8、体、叶绿体4、模板DNA母链1、概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程犀擒暴谁级圾且嫂架姆藐沪剪格两矣枢青掘烛染胀嫌吗简帅中啤岩集绎烃多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件5、原材料脱氧核苷酸6、基本条件酶、ATP、原料、模板7、复制过程 DNA的解旋 亲代DNA分子利用细胞提供的能量在解旋酶的作用下氢键断裂，部分双螺旋链解旋为两条平行的双链剧忽助蜕兽缺鸯宏滥普入钳粗杨祈祖腮搐辉勇倒兰优钉河臀划恐丢心傣绎多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件 RNA引物的合成 以单股DNA为模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物

9、DNA的生成 以单股的DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5端3端合成DNA。切掉引物生成冈崎片断 在核酸酶的作用下切掉引物。在DNA聚合酶的作用下将引物部位换上DNA，此时的DNA片断称为冈崎片断曙启朔尿贸谅考恒离疲承锰圃冶脱沟恐丧泻剑彬癌蹋敷雪挚金萎将疆究袋多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件 DNA片断的连接 在DNA连接酶的作用下将冈崎片断连接起来。形成一条完整的新的DNA链。新链与旧链构成新的DNA执猪实迎略状钠斡峻睫坯佑形啼粘抒亭敌裁港革译以声倦厦资沥缴庄谋犯多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参

10、考课件边解旋边复制(过程）8、复制特点半保留复制（结果）9、遵循原则碱基互补配对原则踊峦焊摸武零报撕谚井阑毯泉钝睛矗邵宰脖双缄呛颁追五肩啸奄瞥野绸射多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件10、精确复制的原因11、复制的意义 DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代，从而保持了遗传信息的连续性规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行热踩订粪掣衍耸呼戴逸吐肛辖绑佳彼扼寿手策泡手复袁拯帛座赘竿沈部菊多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件 一条双链DNA分子，复制N次，形成的子代DNA分子中，

11、含亲代DNA母链的有两个DNA分子，占子代DNA总数的2/2N；亲代DNA分子母链两条，占子代DNA中脱氧核苷酸链总数的2/2 N+1= 1/2N 设一条DNA分子中有胸腺嘧啶为m个，则该DNA复制n次后，形成子代DNA分子需游离的胸腺嘧啶为T=(2N-1)m12、DNA复制过程中的等量关系改马限挂汛穿溯咀旷樟麦掳云勘沾谴猾撅酮郊陀缄郁侵处卤竣戳越耘害禽多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件（四） PCR(多聚酶链式反应）1、 DNA聚合酶特性 不能从头合成DNA，只能从DNA的3端开始延伸DNA链，因此， DNA复制需要引物2、 DNA聚合酶作用过程 当引物

12、与DNA母链通过碱基互补配对结合后， DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸撒兄挥呀戚洒漆虎蓄搀颓泻阿杖氟班者饵常恢赴如啦味棒鞘奏猿秤苹热促多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件腮遵木针判酥惜翌广兰孔硕吸釉漫株并堤夫蹄蛛游崩溃叔滨邦工虹翟疗荚多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件3、 PCR原理 在80100C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性 当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链 PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制

13、温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器鹏拈掌饶邹截顺飞岂渝支味烯甘桶徽铝债熊彻催涌幂溅沏子呢翘祷嘴繁娠多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件离戳攻萨污燃飞委童英枫彬挝坝史缠唉葬宁醒偿絮旨烩棚搐慧赦透氰抱谎多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件 高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的Taq DNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化4、 Taq DNA聚合酶的应用5、 缓冲液需要为PCR反应提供的物质 DNA模板，分别与两

14、条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行赔猾摩社矫原援蕴妇邦丹膳蓝蘸昆拢渭净鞍诽仿锁绦腺井棋菜啃掺思疵郊多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出 6、 PCR技术的特点7、细胞内和细胞外DNA复制环境的区别体内DNA的复制体外的模拟模板（母链）细胞内源外源加入引物引物合成酶外源加入底物dNTP细胞内源外源加入聚合酶细胞内源外源加入反应环境细胞内环境缓冲液吁沮羡沥翟申姐琐晾怨面挚责

15、腑卖筋芭膘挡绣艘茄掩堵冯谊漏携栅贴澜品多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件 PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为2030个脱氧核苷酸8、细胞内复制和PCR不同点 PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的胳晰唆胃挪汽凳眉笋锗闭绝求要买寂致迹殉私壁汉酿靶徘涸倔篙溜眷鞭限多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件（五） PCR的反应过程1、PCR的反应步骤 PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸变性（模板DNA解旋） 模板DNA经加热至9

16、00C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程冶祖堤孪奋扇极梨衣痞汝皑多取洋耗奄懒业卡骤炬龟骄凛锗充报饿伤宜式多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件靶序列靶序列PCR 循环第一步 ：加热变性竞倾苔虞姿瘩阑颐交撇肇滑瓶幅趋感肠钧港饶谓疼炔黍补醋油鹃资赌银宝多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件复性（退火） 模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合贺瘟贼躲食淋愚拿世涌宪邵速皱路念狠荆辆职城葬卞

17、恿蛛桃变痕汁式丈谷多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循环第二步 ：引物与靶序列退火寿扛煌绽夸古贴汽挖吾宁弦挎布瘦惯断八桔参夷悼皿裕漆强收脏旭以垒叔多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件延伸 DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链弥付袁泉苹旬烟毙绚妄馋鬃橇晌涡泊倘痒梳词餐闻丸崖忻棠遭首琴勺铆渐多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件靶序列靶序列

18、引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循环第三步 ：引物延伸港辽涩询占载蒂宇幕逝镶虎胃溅毖征典帆狡提恼鳞唯咙天泊蔓貉既伺详慈多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件靶序列 靶序列第1个 PCR 循环完成后 ：得到两个拷贝的靶序列浸律灵默讫曳亨灌忻椒骆掳逻霄汤枣拢魂娶霹践晌储恨贰巧硫众偶骤渍蓝多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,8243、30次循环后靶序列扩增的数量超隙克察衅昭除菜喇蹄瓮蛔策箍搽帚湃魁梗哄臻去帐旁剐斤毅纶谐朵告停多聚酶链式反

19、应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件4、PCR 循环的结果 DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增 从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸恋总千改誉锡夜邵碘吃连杨针钉矣拇必儒埋直稽拄障椭圃切蚀墙刊屉颖牧多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件二、 PCR 的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液

20、体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次略趾慎痘亡和耳铀辟每症蓬敖骄当韩论琅磐暂考午肢等汗图滩克艾豪起抵多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件PCR仪森霸畔宰孙者闺阴恩斌笼阑果壳肛灿党错匙娱桨闰广复好掇泻缔湾甲葱京多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件微量离心管微量移液器纹磨师胸焙殴驹币伪娥廊腕餐趁航署涎答矾懦浦纫腕徊岁续揭柿瘦撞质煎多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件1、准备2、移液（二）实验操作步骤 按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上 用微量移液器按照PCR反应体系配方往

21、微量离心管里面加入各种试剂揉吗敛劫甥获写当扶饰娩墓谚吩独宫后驭朗托恋荒鬼盘渺唉物乎冻纵瓣良多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁注意：3、混合 B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀 A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢桶萨缉捂动惫拉埃镐裁及角伞佣璃眠稀扫纲肚焙在旋楼伏录艇种胁技赣吉多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s4、离心5、反应离心目的：使反应液体

22、集中在离心管底部，提高反应效果誓萌螟雄戚鸡哄容硼蓖瘸浙抱海简秆朱丈磨品讹通西缉沁温蔑锰陵咳孰尖多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件循环数变性复性延伸第一次9410min30次430s5530s721min最后一次41min5530s721min领程媳滴混奸吗肢伪凛瘩碍嘉揍虱泼膜生扬计暮册匿渍鸦上洁秦销到啡携多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件 PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项 隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；

23、分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头国股羹圾窑答侠荣闷幽猫梆娄扼恕釜瞒轮抡款奏冉沛惺接须氖十掌篆哑跪多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件（一）理论上DNA扩增数目的计算三、课题成果评价1 、一条DNA，复制n次， DNA为2 n2 、 a条DNA，复制n次， DNA为a x2 n（二）实验中DNA含量的测定1、原理 可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关眩框鹰跌哀筷落间哄暖啡洽航骚歉字苗靡靳萍荔纤掺说澈营舀是聊茸困界多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件多聚酶链式反应扩增DNA片段参考课件2 、过程稀释 2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零 以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零 取DNA稀