地中海贫血的分子基础和产前诊断课件

1、地中海贫血的分子基础和产前诊断徐湘民南方医科大学基础医学院School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University北海， 2013年 8月23-25日第1页，共79页。遗传性血红蛋白病Inherited disorders of hemoglobin 异常血红蛋白 Abnormal hemoglobin, Structural variants 地中海贫血 (地贫) Thalassemias -thalassemia -thalassemia 遗传性持续性胎儿血红蛋白 Hereditary persistence of feta

2、l hemoglobin(HPFH)第2页，共79页。血红蛋白病是世界上最常见的出生缺陷之一 全球每年约有790万出生缺陷患儿出生 5中常见的疾病占7000种出生缺陷的25% 血红蛋白病的发病率位于第三位204060801001200全球5种常见的出生缺陷第3页，共79页。地中海贫血全球分布区域中国南方高发地区人群携带率3%-24%Blood Rev, 2012.第4页，共79页。全球血红蛋白病人群负荷Blood, 2011; WHO Statistics, 2012.第5页，共79页。中国异常血红蛋白调查Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.第6页，共79

3、页。中国地中海贫血调查Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.第7页，共79页。Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.中国地中海贫血调查第8页，共79页。广东省地中海贫血的流行病学调查珠海 3140韶关 3444广州 2604汕头 1049湛江 316013,397人份J Clin Pathol, 2004. 西北东南第9页，共79页。8.53%2.54%地贫地贫正常人群88.93%11种突变12种突变地贫携带者约1000万广东地中海贫血流行病学调查J Clin Pathol, 2004. 第10页，共79页。防城港市 22

4、4百色市 834柳州市 790贺州市 1033玉林市 1349南宁市 1559广西地区地中海贫血的流行病学调查5,789人份Clin Genet, 2010.北东南西 汉族：3361 壮族：1670 瑶族： 619 其它： 139第11页，共79页。正常人群75.86%17.55%-地贫6.43%地贫地贫0.16%正常人群75.86地贫17.55%9种突变13种突变广西地中海贫血流行病学调查地贫携带者约1000万Clin Genet, 2010.第12页，共79页。高发区人群遗传负荷评估第13页，共79页。中国南方血红蛋白病人群负荷第14页，共79页。和地中海贫的分子基础 常染色体隐性遗传病

5、致病基因：地贫 - 珠蛋白基因（16p13.3） 地贫 - 珠蛋白基因（11p15.3） 突变纯合子：重型地贫 - 致死 中间型地贫 - 致残 病理学基础： / 链比例失衡第15页，共79页。和地贫的病理学机制和临床分类-珠蛋白基因表达 -地中海贫血临床综合征 正常 正常 -地中海贫血特征 -地中海贫血特征Hb H 病 中间型-地中海贫血 Barts胎儿水肿综合征 重型-地中海贫血 -地中海贫血临床综合征 -珠蛋白基因表达珠蛋白链不平衡16p13.311p15.3第16页，共79页。地中海贫血的临床特征小细胞低色素性溶血型贫血 (中、重度)黄疸肝脾肿大 (脾大明显)骨髓扩增发育迟缓合并感染Ba

6、rts 水肿胎(地贫,宫内或出生后半小时内死亡)第17页，共79页。地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症第18页，共79页。地中海贫血的血液学表型特征 RBC 参数 MCV MCH 细胞形态变化 Hb 成分分析 Hb A2 () 或 () Hb Barts Hb H () Hb E () 第19页，共79页。1 2 3 4 5Normal AA2 AE Barts AF HA+-500V, 25min血红蛋白电泳图谱1. 正常人Hb2. 轻型地贫 3. 异常Hb E杂合子4. 新生儿Hb Barts (4, 地贫标准型）5. Hb H第20页，共79页。中间型地贫的临床特

7、征 轻度黄疸 肝脾肿大(脾大明显) 骨髓扩增 合并感染不需进行常规输血治疗血红蛋白水平维持在60-100g/L水平 发病年龄在2岁以后, 或成年期发病第21页，共79页。中间型地贫的临床特征 轻度黄疸 肝脾肿大 (脾大明显) 骨髓扩增 合并感染不需进行常规输血治疗血红蛋白水平维持在60-100g/L水平发病年龄在2岁以后, 或成年期发病第22页，共79页。重型地贫重型地贫中间型地贫地贫是严重致死、致残性遗传性血液病第23页，共79页。 地中海贫血的防治对策 重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题 通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病 预

8、防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求 第24页，共79页。地中海贫血的预防控制TIF Publication, 2003.第25页，共79页。地中海贫血的研究策略建立一系列诊断标准和诊断技术遗传流行病学调查大人群监控和预防用于基因分型用于产前诊断指导制定计划第26页，共79页。和地贫发生的分子遗传学机制 -珠蛋白基因缺失 中间型地贫: 复杂变异 -珠蛋白基因点突变 第27页，共79页。和地贫发生的分子遗传学机制 -珠蛋白基因缺失 中间型地贫:复杂变异 -珠蛋白基因点突变 第28页，共79页。13种导致中国人-地中海贫血的缺失突变地中海贫血预防控制操作指南. 人民军医出版社, 2011.

9、 第29页，共79页。 2 1 2 1 3HVRinterHVR534个功能性的基因3个功能性的基因2个功能性的基因0个功能性的基因1个功能性的基因正常静止型地贫轻型地贫HbH病Hb Barts胎儿水肿综合征地中海贫血表型和基因型的关系第30页，共79页。12种见于中国人群的导致2/1珠蛋白基因表达降低的突变 CD59 错义突变小缺失或插入终止密码突变移码突变 IVS IIVS II UTRUTR53CD13CD31CD125 CD122 CD142 CD4445CD49CD30CD78 CD74 CD118 21EXON IIEXON I EXON III地中海贫血预防控制操作指南. 人民军

10、医出版社, 2011. 第31页，共79页。中国南方人群不同基因型Hb H病的分布Unpublished Data, 2012.第32页，共79页。 / /3.7 /4.2 WS/ CS/ QS/ SEA/ THAI/ / /3.7 /4.2 WS/ CS/ QS/ SEA/ THAI/ 中国人主要-珠蛋白基因型与血液学表型的关系Unpublished Data, 2012.第33页，共79页。和地贫发生的分子遗传学机制 -珠蛋白基因缺失 中间型地贫:复杂变异 -珠蛋白基因点突变 第34页，共79页。和地贫发生的分子遗传学机制 -珠蛋白基因缺失 中间型地贫:复杂变异 -珠蛋白基因点突变 第35

11、页，共79页。 50 种见于中国南方的导致 珠蛋白基因表达降低的突变 地中海贫血预防控制操作指南. 人民军医出版社, 2011. 第36页，共79页。导致中国人群中间型的+地贫突变 第37页，共79页。6种引起地中海贫血的基因缺失地中海贫血预防控制操作指南. 人民军医出版社, 2011. 第38页，共79页。和地贫发生的分子遗传学机制 -珠蛋白基因缺失 中间型地贫:复杂变异 -珠蛋白基因点突变 第39页，共79页。和地贫发生的分子遗传学机制 -珠蛋白基因缺失 中间型地贫:复杂变异 -珠蛋白基因点突变 第40页，共79页。产前基因诊断：地贫预防的技术基础 人群携带者筛查发现高风险家庭 基于DNA

12、分析的胎儿基因型诊断 胎儿取样 家系分析第41页，共79页。产前基因诊断：地贫预防的技术基础 人群携带者筛查发现高风险家庭 基于DNA分析的胎儿基因型诊断 胎儿取样 家系分析第42页，共79页。 用于携带者检测的表型分析方法 全血细胞计数 MCV (80fL) MCH ( 5% 第52页，共79页。中国南方发现的5种占人群90%的常见地中海贫血基因突变第53页，共79页。地中海贫血的DNA诊断 -地贫:基因缺失分析技术 -地贫:基因点突变分析技术 Reverse Dot Blot （RDB）: 反向点杂交 probe melting curve-based genotyping assay （

13、PMCA）: 基于探针熔解曲线的基因分型 Gap-PCR : 缺口PCR Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification （MLPA）: 多重连接探针扩增 检测基因拷贝数的荧光定量PCR第54页，共79页。第55页，共79页。目前已获准或正在申报产品注册证的检测中国人地贫突变的分子诊断技术 3种缺失型地贫检测试剂盒：单管多重gap-PCR法 17种地贫突变检测试剂盒：反向点杂交法 多位点缺失型地贫检测试剂盒： PCR荧光探针法 25 种地贫突变检测试剂盒：荧光PCR熔解曲线法第56页，共79页。- HW-THAI- FIL - SEA-11Kb

14、 4.2 3.7211 3HVRHVR1210kb0kb20kb 30kb 40kb 50kb53检测基因拷贝数的荧光定量 PCR第57页，共79页。拷贝数相对定量诊断模型 1 基因2个拷贝 看家基因2个拷贝 1 基因1个拷贝 看家基因2个拷贝 1 基因0个拷贝 看家基因2个拷贝Ct值Ct33334No 01482844848无扩增 3个循环 3个循环 3个循环 4个循环16161616048 3个循环16PCR扩增第58页，共79页。三个靶基因拷贝数定量分析结果J Mol Diagn. 2013. 第59页，共79页。864例样品定量诊断特异性评价第60页，共79页。-SEA/, -3.7/

15、-4.2/等基因分型-SEA, -3.7, -4.2 等单倍型分析珠蛋白基因拷贝数-地贫分子诊断: 临床表型与基因分型基因缺失基因缺失基因缺失Gap-PCR定性检测基因缺失待检人基因组DNA-地贫定量与定性检测的比较基因缺失基因缺失基因重复第61页，共79页。PMCA检测原理及流程图J Mol Diagn, 2011. 第62页，共79页。25种地贫突变熔解曲线图谱第63页，共79页。与传统RDB检测方法的比较SamplesVariant IdentifiedPCR/melting analysisHybridizationMembrane WashingPCRRDBMeltProSignal

16、 DevelopmentPCRDirect SequencingPCR Clean-UpSequencing PCRCapillary Electrophoresis(260 min)Variant IdentifiedVariant Identified(370 min)(160 min)30 min3 reactions100 min15 min100 min120 min45 min120 min2 reactions160 min1 reaction100 min第64页，共79页。 和地中海贫血的预防计划 目前基于人群筛查的预防模式 扩展家系筛查计划 基于医院水平的预防计划 基于社区

17、或行政区的预防计划第65页，共79页。人群干预可以降低出生缺陷发生率 世界卫生组织的出生缺陷“三级预防”策略 一级：婚前检查 二级：产前筛查和产前诊断 三级：患儿治疗 孕前和孕期干预是我国出生缺陷预防的重点 探索基于社区的出生缺陷预防模式 第66页，共79页。 斗门区 金湾区 香洲区 统一调度 质量控制 转诊病例确诊 高风险对象建档 产前诊断一级技术中心 宣传教育 携带者筛查 病例转诊 遗传咨询 随访二级检测站斗门市妇幼保健院唐家镇医院香州区妇幼保健院珠海市妇幼保健院横琴医院金湾区妇幼保健院珠海市地中海贫血预防现场的二级网络模式第67页，共79页。珠海市1998-2005人群筛查及产前诊断结果

18、 第68页，共79页。1998-2005珠海市地贫婚前/产前筛查及产前诊断结果产前诊断：98 例地贫 44 例地贫 14 例重型地贫 27 例Barts水肿儿和Hb H病 筛查发现的阳性孕妇或阳性夫妇 地贫 地贫 地贫 地贫 4.5% 2.3% 1.6% 0.7%筛查阳性对象数: 6563对 4312 2251 103对 45对中华医学遗传学杂志, 2008. 第69页，共79页。2010年，卫生部与广西政府合作开展由政府买单为民服务的“地中海贫血防治” 省部共建惠民工程该工程计划在5年内将广西地贫患儿出生率下降50%卫生部与广西共建卫生惠民工程：广西地中海贫血防治计划 第70页，共79页。政

19、府组织第71页，共79页。公益宣传第72页，共79页。技术培训 南方医科大学：地贫实 验室技术骨干培训基地 卫生部举办9省市地贫防 控适宜技术师资培训班第73页，共79页。广西地中海贫血防治计划培训教材第74页，共79页。广西地区地贫人群预防三级网络第75页，共79页。地贫预防项目的社会效益可为国家和家庭节约巨额的社会消耗第76页，共79页。研究基金： 国家自然科学基金 国家科技计划项目 卫生部行业科研专项基金 广东省科技计划项目 军队医学重点课题基金致 谢合作单位：广东省人口和计划生育委员会广西壮族自治区卫生厅广西壮族自治区妇幼保健院广州市妇女儿童医疗中心珠海市妇幼保健院柳州市妇幼保健院中国

20、人民解放军第三0三医院深圳益生堂生物企业有限公司“973”计划 “863”计划国家科技支撑计划第77页，共79页。树立质量法制观念、提高全员质量意识。8月-228月-22Friday, August 5, 2022人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。02:36:0002:36:0002:368/5/2022 2:36:00 AM安全象只弓，不拉它就松，要想保安全，常把弓弦绷。8月-2202:36:0002:36Aug-2205-Aug-22加强交通建设管理，确保工程建设质量。02:36:0002:36:0002:36Friday, August 5, 2022安全在于心细，事故出在麻痹。8月-22

21、8月-2202:36:0002:36:00August 5, 2022踏实肯干，努力奋斗。2022年8月5日2:36 上午8月-228月-22追求至善凭技术开拓市场，凭管理增创效益，凭服务树立形象。05 八月 20222:36:00 上午02:36:008月-22严格把控质量关，让生产更加有保障。八月 222:36 上午8月-2202:36August 5, 2022作业标准记得牢，驾轻就熟除烦恼。2022/8/5 2:36:0002:36:0005 August 2022好的事情马上就会到来，一切都是最好的安排。2:36:00 上午2:36 上午02:36:008月-22专注今天，好好努力，剩下的交给时间。8月-228月-2202:3602:36:0002:36:00Aug-22牢记安全之责，善谋安全之策，力务安全之实。2022/8/5 2:36:00Friday, August 5, 2022相信相信得力量。8月-222022/8/5 2:36:008月