大学生物化学教学课件基因工程

1、基因重组与基因工程第1页，共41页。1、基因重组：指不同来源的DNA在细胞内重新进行组合，并能进行复制、转录、翻译的过程。2、基因工程：在体外用人工的方法进行基因的重新组合，再把重组基因导入到细胞或细菌内进行复制、转录、翻译的技术。第2页，共41页。第一节 自然界的基因转移和重组无目的-自然界的基因转移和重组 自然界不同物种和个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。有目的-基因工程第3页，共41页。第一节 DNA的转移和重组 （DNA transfer snf recombination)DNA重组包括： 同源重组（homologous recombinati

2、on) 特异位点重组（site-specific recombination) 转座重组（transpositional recombination)第4页，共41页。 一、同源重组（基本重组） 发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 为最基本的DNA重组方式，在原核、真核生物均发生。 第5页，共41页。二、位点特异性重组（site - specific recombination）由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称。 此过程往往发生在一个特定的短的（20200bp ) DNA序列内（重组位点），并且有特异的酶和

3、辅助因子对其识别和作用。 第6页，共41页。三、转座重组 有些基因可以从一个位置移动到另一位置.可移动DNA序列包括：插入序列、转座子 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座。 第7页，共41页。（一）插入序列(insertion sequences，IS)转座 典型插入序列：750-1500 bp DNA片段 包括：两个分离的反向重复（IR)序列; IR侧翼有短的正向重复序列; 及 一个转座酶编码基因. 保守性转座：插入序列从原位迁至新位.复制性转座：插入序列复制后，其中一个复制本迁至新位，另一个保留在原位.第8页，共41页。（二）转座子(transposons)转座 可从一个染色体

4、位点转移至另一位点的分散的重复序列，即一段可以发生转座的DNA。 组成：侧翼为两个分离的反向重复序列； 转座酶基因； 抗生素抗性等有用的基因。第9页，共41页。第二节 重组DNA技术基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为克隆）和行使正常功能（称之为表达），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 克隆（clone）： 来自同一始祖的相同副本或拷贝（copy）的集合。第10页，共41页。完整DNA克隆过程包括： 目的基因获取； 基因载体选择、构建； 目的

5、基因与载体拼接； 重组DNA分子导入受体细胞； 筛选重组体 目的基因的表达。重组DNA 技术 （recombinant DNA） 又称基因克隆（gene cloning）第11页，共41页。（二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶逆转录酶 T4 DNA连接酶第12页，共41页。限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)定义识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H切割DNA后产生含5磷酸和3羟基的末端第13页，共41页。类酶识别序列特点 回文结

6、构(palindrome) 切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG第14页，共41页。GTCCAGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口Bam HGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGG粘端切口第15页，共41页。异源同功酶，同裂酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst第16页，共41页。同尾酶酶不同、识别序列不同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatib

7、le end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A第17页，共41页。酶不同、识别序列相同，产生相同的粘性末端，称为同功异源酶。酶不同、识别序列不同，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。第18页，共41页。（二）DNA聚合酶 DNA pol I： klenow 片段： Taq DNA pol PCR反应第19页，共41页。（三）DNA ligaseDNA相邻的5-P和3-OH之间形成磷酸二酯键，切口封合或片段连接。1、 T4 DNA ligase ：催化相同黏性末端或平头末端的DNA分子的连接。2、大

8、肠杆菌DNA ligase :催化相同黏性末端的连接.第20页，共41页。二、基因工程的载体定义 vector为携带外源DNA进入宿主细胞（无性繁殖或表达）的工具（DNA分子）。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA第21页，共41页。克隆载体(cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成蛋白质而特意设计的载体称为表达载体。第22页，共41页。载体的选择标准：能在宿主细胞中自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），

9、常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。作为表达载体，具有与宿主细胞相适应的调控元件：启动子，增强子等。第23页，共41页。（一）质粒（plasmid）： 存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子， 可在宿主细胞中自主复制，并在细胞分裂时传给子代。 质粒感染细菌后，会赋予宿主细胞一些遗传性状（如对青霉素或重金属的抗性)可作为筛选转化子细菌的根据。第24页，共41页。 pBR322质粒(4361bp) : 主要包括：限制性内切酶位点（插入外源基因）；含有terr、ampr抗药基因，可作为筛选标志。含有复制起始点ori（赋予其复制特性）。4361bp第25页，共

10、41页。M13噬菌体： M13mp系列 pUC系列 pUC质粒:加入E.coli的LacZ的N端146个AA残基的编码基因，编码产物为半乳糖苷酶的片段。 LacE.coli（突变型宿主细胞）：可表达该酶的片段. 单独存在的或片段均无活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段，宿主细胞才有半乳糖苷酶活性，使特异底物产生蓝色化合物（-互补)。第26页，共41页。（三）目的基因：感兴趣的基因或DNA序列。 目的基因，又称目的DNAcDNA基因组DNA外源DNA第27页，共41页。（一）目的基因的获取1. 化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。2.基因组DNA文库(geno

11、mic DNA library)3. cDNA文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 第28页，共41页。（三）外源基因与载体的连接粘性末端连接 同一限制酶的酶切: 重组子、载体自连、目的基因自连 不同限制酶的酶切： 重组子第29页，共41页。目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组体载体自连目的基因 自连目 录同一限制酶的酶切：第30页，共41页。两个不同限制酶的酶切 ： 使目的DNA按正确的方向插入第31页，共41页。受体菌条件安全宿主菌，由大肠杆菌K12改造，在人的肠道几乎不能存活。 限制

12、酶和重组酶缺陷处于感受态(competent) 导入方式转化 (质粒DNA分子导入细菌的过程）转染 (噬菌体、病毒携带DNA分子导 入宿主细胞的过程)（四）重组DNA导入受体菌第32页，共41页。（五）重组体的筛选 1. 直接选择法(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法原位杂交Southern印迹 2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等第33页，共41页。四环素抗性基因（Tetr）失活(插入失活法)抗药性标记选择第34页，共41页。 互补的检测片段片段片段片段第35页，共41页。原位杂交第36页，共41页。重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结分分离目的基因 切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体 转转入受体菌 筛筛选重组体 扩增或表达第37页，共41页。重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNA cDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交第38页，共41页。 以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程扩增或表达第39页，共41页。克隆基因在大肠杆菌中表达 克隆基因在哺乳动物细胞