体内药物分析z教学课件

1、体内药物分析Biopharmaceutical analysisChap.5第1页，共78页。8/3/20221体内药物分析第一节 体内药物分析概述 药物分析的重要分支学科 研究生物机体中外源性药物及其代谢物 和内源性活性物质的质与量的变化规律综合性较强的应用学科分析方法学治疗药物监测研究的重要的实验手段第2页，共78页。8/3/20222体内药物分析 药物进入体内后 经过吸收、分布、代谢和排泄等动力学过程 化学结构和存在状态都可能发生变化 在不同个体中存在差异（个体差异） 进而直接影响到药物在不同个体中的治疗效应和毒副作用 需对生物体内药物及其代谢物进行研究分析第3页，共78页。8/3/20

2、223体内药物分析 狭义：利用现代分析仪器和分离手段对人和动物血液、尿和组织等样品进行定性定量的分析 广义：通过体内药物浓度的分析，了解药物在体内的数量和质量的变化，获得药代动力学参数，为药品的生产、临床应用作出评价 体内药物分析的定义第4页，共78页。8/3/20224体内药物分析一 体内药物分析的性质 体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学 在探求科学用药规律与安全、有效、合理用药，在开发新药、保障健康长寿方面具有重要作用第5页，共78页。8/3/20225体内药物分析 二 体内药物分析的作用和意义 通过检测人（或动物）的体液或组织（生物样本

3、）中的药物或特定代谢物的浓度，为临床药学研究提供必要的数据和相关信息第6页，共78页。8/3/20226体内药物分析第7页，共78页。第8页，共78页。（二）临床合理用药中的意义 1血药浓度与药理作用2. 影响血药浓度的因素（1）机体因素 a生理因素 年龄、性别、生理状况 b病理因素 c遗传因素（2）药物因素 a剂型因素（生物利用度问题） b药物合并使用（酶抑、酶促） c时间因素第9页，共78页。8/3/20229体内药物分析（三）药物中毒解救的意义 药物中毒的诊断和治疗方案的确立（四）兴奋剂检测的意义 包括麻醉药精神药品滥用，吸毒及运动员违禁药品检测第10页，共78页。8/3/202210体

4、内药物分析3从样品的来源分1从分析物分母体药物代谢物内源性物质2从生物样品种类分均匀样品 非均匀样品人体实验动物三 体内药物分析的对象 第11页，共78页。8/3/202211体内药物分析体内药物分析的对象 研究对象 评价药物的安全性（临床前研究）动物 评价药物的有效性（临床研究）人体（健康志愿者或患者） 用药的安全、有效与合理人体（患者TDM ）具体检材 生物体的各种器官、组织和体液等第12页，共78页。8/3/202212体内药物分析四 体内药物分析的任务 1. 分析方法学的研究和完善 提供灵敏、专属、准确可靠的分析方法与最佳的分析条件（首要任务） 第13页，共78页。8/3/202213

5、体内药物分析2. 治疗药物监测 TDM，therapeutical Drug Monitoring 只有具有明确治疗范围，血药浓度和药效关系密切，且具有下列情况者，要求进行药浓检测： 有效血药浓度范围窄，剂量小，毒性大的药物； 药代动力学个体差异大、药理作用强、不易估计给药后的血药浓度药物；第14页，共78页。8/3/202214体内药物分析药物的毒性反应与该药治疗的疾病症状相似，难以判断是剂量不足还是药物毒性所致； 联合用药时，由于药物相互作用产生不良反应，需要调整药物剂量者； 在短期内难于判断疗效的药物，预测药物能否达到预防效果； 判断患者用药的依从性等要求进行药物浓度检测。TDM第15页

6、，共78页。8/3/202215体内药物分析3. 药代动力学的研究 药物动力学参数、生物利用度及血浆蛋白结合率等基本数据 为新药研究、老药再评价、TDM、药物滥用、司法鉴定等提供准确的体内药物浓度数据和合理解释4. 代谢分型的应用5. 内源性物质测定 为某些疾病的诊断及治疗提供重要信息 第16页，共78页。8/3/202216体内药物分析五 体内药物分析的特点 由分析对象的特点所决定 1干扰物质多，样品一般均需经过分离、净化后才能进行分析 生物样品中含有大量的内源性物质，如蛋白质、脂肪等，以及代谢物、结合物等干扰分析2样品量少、不能重复取样 生物样品多数在特定条件下采集，无法再次取样，且浓度低

7、、变化幅度大 测定前需浓缩、富集以适应分析方法要求 第17页，共78页。8/3/202217体内药物分析3被测药物和代谢物的浓度或活性极低 对方法的灵敏度及专属性要求较高 4要求分析方法简便、快速 药物浓度监测和药物滥用及毒物分析中5. 工作量较大，随着工作的深入开展，会成倍地甚或按指数级数6. 测定数据的处理和阐明有时不太容易 第18页，共78页。8/3/202218体内药物分析六 体内药物分析的一般步骤 分析方法建立 分析方法的验证 体内药物分析的实际应用第19页，共78页。8/3/202219体内药物分析（一）对分析方法的新要求 药物服用的剂量越来越小、体液中药物浓度越来越低，对体内药物

8、分析方法提出了新的要求： 1. 检测方法的高灵敏度 最低检测量10-910-7g 或10-15 10-12g 2. 分离方法的高选择性、高专属性 第20页，共78页。8/3/202220体内药物分析 1. 色谱法 GC、HPLC、HPCE 2. 免疫分析法 RIA、EIA 3. 联用技术 GC-MS、LC-MS为满足各项要求，最常用的分析方法有第21页，共78页。8/3/202221体内药物分析（二）体内药物分析的常用分析方法1. 光谱法 分光光度法、紫外光度法、荧光光度法 特点：操作简便，所需仪器一般临床实验室都具备，检测成本低，便于推广 适于对治疗血药浓度水平较高，经适当处理方法用光谱法能

9、满足临床需要的药物 如 阿司匹林、对乙酰氨基酚、氨茶碱、苯妥英钠、苯巴比妥钠等 第22页，共78页。8/3/202222体内药物分析 气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC) 特点： 特异性、灵敏度和重复性均好，并可一次同时完成同一样本中多种药物及其代谢物检测 联用技术 如 GC-质谱、HPLC-质谱联机检测，更拓展了这类分析手段的性能 2. 色谱法第23页，共78页。8/3/202223体内药物分析3. 免疫化学法 主要有放射免疫法(RIA)、荧光免疫法(FIA)和酶免疫法(EIA) 根据抗原-抗体反应的特异性，应用免疫化学法检测半抗原或抗原性药物， TDM应用的免疫化学法一般都采用竞

10、争性免疫分析 只有具备完全或半抗原性的药物，并能制备特异性抗体，才可用免疫化学法进行TDM 第24页，共78页。8/3/202224体内药物分析 特点： 免疫化学法灵敏度极高，大多可达ng甚至pg检测水平，可满足所有药物TDM的要求；所需标本量少，预处理及测定操作简便，并可制成商品化试剂盒；可利用一般生化、荧光自动分析仪进行自动化操作 在体内几乎不发生代谢转化而以原型排泄的药物，较少代谢物干扰，尤其适用于免疫法检测，如 庆大霉素等氨基甙类抗生素第25页，共78页。8/3/202225体内药物分析在体药物分析示意图 微透析系统活体实验动物微透析探针管子微注射器灌注液微注射泵检测系统分析仪器第26

11、页，共78页。8/3/202226体内药物分析 治疗药物监测（therapeutic drug monitoring，TDM ）是自本世纪60年代起，在临床药理学、药代动力学和临床化学基础上，结合现代分析检测技术，形成和发展的一门应用性边缘学科 第二节 治疗药物监测第27页，共78页。8/3/202227体内药物分析 TDM 对临床药物治疗的指导，主要是指设计或调整合理的给药方案，同时为药物过量中毒的诊断和处理提供有价值的实验依据 近年来国外又将其统称为临床药代动力学监测（Clinical Pharmacokinetic Mornitoring, CPM ）第28页，共78页。8/3/2022

12、28体内药物分析 通过灵敏可靠的方法，检测病人血液或体液中的药物浓度，获取有关药动学参数，应用药代动力学理论，指导临床合理用药方案的制定和调整，以及药物中毒的诊断和治疗，以保证药物治疗的有效性和安全性，实现合理的给药方案个体化一 治疗药物监测的主要任务第29页，共78页。8/3/202229体内药物分析 治疗药物监测的核心目的是实现合理的给药方案个体化 协助诊断和处理药物过量中毒，及进行其临床药理学研究 了解患者是否遵医嘱用药，提高用药依从性二 治疗药物监测的目的 第30页，共78页。8/3/202230体内药物分析 血药浓度结果用于调整剂量，设计个体化给药方案 一般只监测一次血药浓度，不测药

13、物经时变化浓度 监测方法要求快速、简便、准确，以适应临床需求治疗药物监测与临床药代动力学研究的区别第31页，共78页。8/3/202231体内药物分析 治疗药物监测（TDM ）利用各种分析技术测定血浆或组织中药物的浓度，并根据药代动力学的原理和公式来指导个体化给药方案，以提高疗效，避免或减少毒副作用的发生；为药物过量中毒的诊断和处理提供实验室依据三 治疗药物监测的意义第32页，共78页。8/3/202232体内药物分析 据世界卫生组织（WHO）及我国卫生部药物不良反应监测中心的统计资料均显示，因用药不当而致死者远远高于同期死于各种传染病的人数。而用药不当死亡者中，大多是剂量不当所致。 随着医疗

14、技术整体水平的提高，在TDM 指导下制定和调整个体化的合理用药方案，是药物治疗学发展的必然趋势 第33页，共78页。8/3/202233体内药物分析 临床治疗中的常规血药浓度监测是指测定规律服用某药物 5 个半衰期后已达稳定的血药浓度 用一般剂量或超过一般剂量仍不能控制病情时，通过监测可以了解病人是否规律用药、代谢率是否加快、有无耐药现象等 四 何时需要进行治疗药物监测 第34页，共78页。8/3/202234体内药物分析 联合应用药物，有可能影响药物代谢时或需要了解药物间的相互作用时 伴发其他疾病(如肝、肾、胃、肠道疾病和低蛋白血症)时 药物的有效血药浓度范围狭窄（代表药物地高辛、奎尼丁等）

15、，在临床上不易区分毒性反应和确定剂量时，特别是有效量和中毒量接近的药物，通过测定可以及时调整药量 第35页，共78页。8/3/202235体内药物分析 某些药物的毒副作用表现与某些疾病本身的症状相似，不能明确辩别时（如地高辛、速尿等） 长期用药的患者，依从性差；或产生耐药性； 以及原因不明的药效变化时 出现特殊的症状和反应，怀疑是药物中毒时 第36页，共78页。8/3/202236体内药物分析以下情况下无需TDM监测 药物本身具有客观有效的效应指标时 血药浓度不能预测药理作用强度时 有效血药浓度范围宽的药物，一般也不需要做 TDM第37页，共78页。8/3/202237体内药物分析 患者接受监

16、测品种的药物治疗时，是否需要监测血药浓度，应根据临床具体情况判断。药师应协助临床严格把握TDM适应症，避免不必要的TDM申请 五 进行治疗药物监测应注意的问题 1 严格把握TDM适应症，避免不必要的血药浓度测定第38页，共78页。8/3/202238体内药物分析 2快速提供准确的血药浓度测定结果 3直接面对临床开展TDM工作 药师往往同时承担实验室技术人员、临床药师的双重任务，在做好实验室工作的同时，应深入临床，开展血药浓度的解释、利用工作 4 具体工作中熟练运用专业技能第39页，共78页。8/3/202239体内药物分析六 监测的药物种类 1）强心苷类2）抗心律失常药3）抗癫痫药4）三环类抗

17、抑郁药、抗狂躁药5）抗哮喘药6）氨基糖苷类及其他抗生素、抗肿瘤药7）免疫抑制剂及抗风湿药等 需要指出的是，滥用TDM 将造成不必要的浪费，应根据监测的原则和临床指征，确定有无必要进行常规化监测第40页，共78页。8/3/202240体内药物分析需进行TDM的主要药物分 类 药 品强心甙 地高辛、洋地黄毒苷抗心律失常药 利多卡因、普鲁卡因胺、奎尼丁、乙胺碘呋酮、因卡胺、异丙吡胺等抗癫痫药 苯妥英铵、苯巴比妥、乙琥胺、卡马西平、丙戊酸钠受体阻断剂 普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔平喘药 氨茶碱抗抑郁药 丙咪嗪、阿米替林、去甲替林等抗躁狂症药 碳酸锂解热镇痛药 阿司匹林、对乙酰氨基酚抗生素 庆大霉素、链

18、霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、氯霉素等抗恶性肿瘤药 甲氯蝶呤等免疫抑制剂 环孢素利尿药 呋塞米（速尿）第41页，共78页。8/3/202241体内药物分析七 治疗药物监测与体内药物分析的关系 治疗药物监测的要求促进了体内药物分析学科的发展 体内药物分析学为治疗药物监测提供分析方法和技术支持 体内药物分析的发展和技术进步反过来促进了治疗药物监测的发展和完善第42页，共78页。8/3/202242体内药物分析一、生物样品的种类、采集和制备 血液(血浆、血清)体现药物浓度和治疗作用之间的关系 最常用的生物样本生物样品脏器组织体液血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、精液、脑脊液、泪液、胆汁、胃液、胰液、淋巴

19、液、粪便等第三节 生物样品的预处理第43页，共78页。8/3/202243体内药物分析（一）样品的采集1血样 血样浓度与作用点的浓度密切相关，可以反映靶器官的浓度。 血细胞血浆（plasma）血小板血清（serum）血细胞测定血样中平均分布于细胞内和细胞外的药浓抗凝自然全血血液第44页，共78页。8/3/202244体内药物分析血样主要应用于： 药物动力学 生物利用度 临床治疗药物浓度监测第三章 生物样品与样品制备第一节 生物样品的种类采集 血样的应用第45页，共78页。8/3/202245体内药物分析2尿样 目的：药物剂量回收，药物清除率，生物利用度和，预测药物代谢过程、类型 体内药物清除主

20、要是通过尿液排出，药物以原型、相及相代谢物等多种形式排出 特点：浓度高，易于收集，体内代谢研究，应水解分离第46页，共78页。8/3/202246体内药物分析3唾液 一些药物的唾液药浓(S)与血浆游离药浓(P)密切相关，因此：TDM中利用对S的测定代替对P的监测药代动力学的研究 收集方法 离心 收集第47页，共78页。8/3/202247体内药物分析（二）样品的贮藏1血样（血浆、血清）及时分离冷藏， -70加入稳定剂NaF2尿样 尿中水、无机盐、尿素等细菌的生长， 4保存 加入防腐剂 a1%甲苯 b饱和氯仿 cpH改变3唾液：同血样第48页，共78页。8/3/202248体内药物分析二、生物样

21、品的预处理（一）预处理的目的 存在形式的多样性 游离 结合 代谢物 浓度低，杂质多（分离浓缩） 出现浑浊和沉淀 与试剂起反应 影响色谱柱寿命第49页，共78页。8/3/202249体内药物分析（二）处理方法选择的一般原则1药物理化性质 pKa 亲脂性 挥发性 溶解度 光谱特征 稳定性2浓度范围 灵敏的方法3测定的目的 定性 定量 母体 代谢4生物样品的种类5样品处理与分析方法的选择 专一性 灵敏性第50页，共78页。8/3/202250体内药物分析（三）生物样品去蛋白处理1加入与水能混溶的有机溶剂及中性盐 甲醇 乙腈 甲醇1:2 乙腈1:1.5 （NH4）2SO4 NaCl2加入酸性沉淀剂 三

22、氯醋酸 高氯酸 苦味酸等 使蛋白质分子的阳离子形成不溶性盐而，pH低于等电点第51页，共78页。8/3/202251体内药物分析3组织酶消化法加入酶使蛋白质水解优点：平衡条件下进行，可避免反应和降解 可改善对蛋白结合率强的药物的回收率 不产生乳化4其他 加热 超滤 第52页，共78页。8/3/202252体内药物分析（四）生物样品中缀合物水解1酸水解 2酶水解 -葡萄糖醛酸苷酶 芳基硫酸酯酶 混合酶 pH4.5-7.0 373溶剂解 某些药物的硫酸酯，往往加入率取溶剂时发生分解，同时提取有机溶剂中第53页，共78页。8/3/202253体内药物分析（五）生物样品的萃取1液-液萃取（1）优点：与

23、杂质分离 简便 浓集 提取率高（2）提取率：在有机相与水相中的溶解度的比值分配系数，一般少量多次，对生物样品一般一次萃取， 70%重现性第54页，共78页。8/3/202254体内药物分析（3）影响提取率的因素 pH 碱性药物在碱性pH 酸性 酸性pH 提取溶剂 相似相溶原理 沸点低，不影响检测,性质稳定，不起化学反应 离子强度 加入中性盐 增加离子强度，与水结合强，便于有机溶剂提取 第55页，共78页。8/3/202255体内药物分析（4）离子对提取 对于离子性特强，水溶性极大的药物，可采用离子对提取原理应用阴离子：COOH+ SO3H- 反离子 四丁基铵阳离子：NH2+ 反离子烷基或芳基磺

24、酸盐（5）提取技术 一般在试管中进行,有机相与水相比1:1或2:1第56页，共78页。8/3/202256体内药物分析（6）乳化问题措施 轻缓振摇 含有分散度大或不溶物应过滤掉 避免在高pH条件下，从水中提取药物 避免使用易发生乳化的溶剂 萃取剂水中加入少量NaCl第57页，共78页。8/3/202257体内药物分析破乳方法 机械法 加入少量高级脂肪醇 改变表面张力 改善混合溶剂比例，增加分散相分数（7）药物的吸附 玻璃容器吸附 1%三甲一氯硅烷 10%二甲二氯硅烷 血浆 第58页，共78页。8/3/202258体内药物分析2液固萃取固相萃取solid phase extraction SPE

25、针管式 抽空减压 加压 过滤第59页，共78页。8/3/202259体内药物分析（1）固相萃取步骤固相选择 样品1ml 1ml规格固相 125ml 3ml规格固相固相处理 反相C18 固定相的610倍体积甲醇洗柱，使溶剂化； 610倍水缓冲服液冲洗达分离状态上样分离 用适当的弱溶剂洗涤 洗去杂质，通N2干燥固相洗脱待测物 改变pH或极性 第60页，共78页。8/3/202260体内药物分析（2）影响固相萃取的因素 流速 流速快，按触不充分，样品流失 回收率低 柱处理 510mlmin-1 洗脱 0.21mlmin-1（300mg 25mlmin-1（300mg） 装样 过载 突破性试验 已知浓

26、度样品液 小体积上柱洗脱回收百分率 加大体积洗脱回收百分率 绘图 当回收率下降时为过载 第61页，共78页。8/3/202261体内药物分析（六）生物样品的组分浓集（七） 衍生化处理 GC衍生化 HPLC衍生化第62页，共78页。8/3/202262体内药物分析第四节 体内药物分析方法的建立与评价一、分析方法灵敏度专属性光谱法+刚开始应用较多双波长，导数色谱法+HPLC GC免疫法+免疫交叉反应，重现性差 根据药物理化性质，结构特征，药物浓度，干扰成分大小，实验目的第63页，共78页。8/3/202263体内药物分析二、分析方法的设计依据方法的建立原始方法改进创新创立方法第64页，共78页。8

27、/3/202264体内药物分析1做好文献总结2充分了解药物特征及体内状况 pH、亲脂性、溶解度、极性、光谱特征、药动学参数、体内代谢情况3明确测定目的、要求目的药浓监测药代动力学研究母体药物和代谢物4结合实验室条件 设备条件 预处理方法第65页，共78页。8/3/202265体内药物分析三、分析方法的建立1纯品进行测定 确定线性范围、灵敏度、反应条件（pH、t、T）2空白样品测定 确定空白样品是否有干扰3以水代替空白样品，加标准液后测定 了解提取率、检测浓度 确定萃取条件、pH、挥发浓缩等4空白样品加入标准液测定 标准曲线建立 回归方程 回收率5实验样品测定 第66页，共78页。8/3/202

28、266体内药物分析四、分析方法的评价可行性和可靠性 1准确度 accuracy 测定结果与真实性的差异 用回收率表示 接近100% 相对恒定第67页，共78页。8/3/202267体内药物分析绝对回收率 也称萃取回收率、提取回收率 测定血浆样品中药物浓度/相同浓度的标准液=绝对回收率 考虑3个浓度（高、中、低） 分布在标准曲线成上、中、下一般要求绝对回收率在70%一般方法 HPLC内标 内标法时注意：药物与内标用各自外标法测定回收率应相近，差值10%第68页，共78页。8/3/202268体内药物分析 相对回收率方法回收率药物系列浓度+血样标准曲线 取高、中、低三浓度加入到空白血浆中，处理后测定，与加入标准量相比，得方法回收率，测定值15%，定量限20%注意问题： a加入药量与实际测定值相近 b加入物与实际存在状态相近 c空白试验 与已确定方法进行比较第69页，共78页。8/3/202269体内药物分析2精密度precision标准差SD相对标准性偏差 RSD不大于15%，定量限不大于20% 日间精密度日内精密度第70