蔗糖酶的分离提纯及酶促

1、蔗糖酶的分离提纯及酶促反应动力学实验 （综合性大实验） 2022/8/21 内容提示 本实验含如下内容（1、2、3是酶分离提纯及比活力测定部分的内容；4、5是酶促反应动力学部分的内容）：1、 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法（DNS法）工作曲线的制 作及三种蔗糖酶样品（E1、E2 、E3）的测定（酶活力）；2、 Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作及三种蔗 糖酶样品（E1、E2 、E3）的测定（蛋白质含量）；3、蔗糖酶的分离提纯（细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、 透析和离子交换柱层析装柱、上样、洗柱、洗脱、收 集酶活力峰、保存）；4、蔗糖酶米氏常数的测定（用双倒数法）；5、用正交法测定几种

2、因素对蔗糖酶活力的影响（含实验设 计及数据处理的相关知识）。2022/8/22 一、目的要求 1.熟悉工作曲线的制作方法及使用注意事项； 2.学习掌握3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理和方法；3.学习掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；4.学习酶蛋白分离提纯的原理；5.学习掌握细胞破壁、抽提、有机溶剂分级、透析和离子交换柱 层析技术； 6.学习掌握酶的比活力测定及其计算方法；7.学习掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法、选择确 定酶促反应最适条件（温度、pH值、离子浓度等）的方法；8.学习正交试验法中最简单的入门知识：用正交表设计 试验方案、用极差分析处理试验数据并分析试验

3、结果。2022/8/23 二、实验原理 前 言 酶是生物体内具有催化功能的蛋白质，可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件和含量测定方法。 酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比活力）及收率；依据在溶液中的性质（分子大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离; 胞内酶的分离提纯步骤：选材、破壁、提取、分离、纯化、测活、保存；用测定酶活力的方法跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。 酶促反应的动力学（反应速度及影响因素）: 1）底物浓度对酶促反应速度的影响 2）酶浓度对酶促反应速度的影响 3）pH值对酶促反应速度的影响 4）温度对酶促反应速度的影响 5）激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响.2022/8/24

4、2022/8/252022/8/262022/8/274、Folin-酚法测定蛋白质含量的原理： 1）凡含有两个及两个以上肽键（CONH）的化合物（如双缩脲：H2NCONHCONH2），在碱性溶液中（如Folin-甲试剂）都能与Cu2+作用，形成紫色的复合物； 2）蛋白质是由多个氨基酸通过肽键连接起来的，故所有的蛋白质均可与Folin-甲试剂反应，形成紫色的铜-蛋白质复合物； 3）铜-蛋白质复合物在pH=10的碱性溶液中可将磷钼酸-磷钨酸（Folin-乙试剂）还原成兰色的钼蓝和钨蓝混合物，其颜色的深浅（在一定范围内）与蛋白质的含量成正比； 在测定液体蛋白质样品含量的常用方法中（双缩脲法、 Fo

5、lin-酚法和紫外吸收法），Folin-酚法的灵敏度最高（比紫外吸收法高10-20倍，比双缩脲法高100倍），所以我们选用本方法。2022/8/285、有机溶剂分级沉淀的原理： 有机溶剂分级是利用不同Pr在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。 其原理是： 1）有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加Pr分子上不同 电荷的引力，使蛋白质的溶解度下降； 2）有机溶剂与水作用，能破坏Pr的水化膜，使蛋白质的 溶解度下降。6、离子交换柱层析的原理： 是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异，使其分离的技术。在分离过程中，以离子交换作用为主导；在众多的交换剂中，离子交换纤维素的优点是：202

6、2/8/291）有开放性的长链结构、较大的表面积，所以对Pr 的吸附容量大；2）纤维素上离子基团的数量不多且排列疏散，对 Pr的吸附不是太牢固，所以用缓和的洗脱条件即 可达到分离的目的，不致引起Pr的变性；3）用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都 不会发生体积的改变，所以有利于Pr的层析。 本实验中使用的DEAE-c11是弱碱性的阴离子纤维素，其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基。该纤维素的吸附量大，分辨率高，化学性质稳定。2022/8/210 三、实验流程 周三晚上6：00开始 周四下午1：00开始1、制备蔗糖酶粗品E1 2、制作DNS比色定糖的工作曲线 （当天画出工作曲线）

7、自溶 3、制作Folin-酚法测定蛋白质 含量的工作曲线 （当天画出工作曲线） 抽提 （过夜）2022/8/2114、乙醇分级和透析（制E2） 离心得E1（无细胞抽提液） 取样、测定酶E1活力及蛋白质浓度 第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度） 第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度） 透析（过夜） 2022/8/2125、柱层析的准备工作 组装层析装置装柱、柱平衡（过夜） 2022/8/2136、 柱层析（制E3） 周五下1：00开始 离心（得E2 ） 取样、 测酶E2活力及蛋白质浓度 上样 洗柱（用目测酶活力的方法检测目的酶是否挂上） 洗脱 合并酶活力峰,得E3 保存成品E3 测酶E3活力及蛋白

8、质浓度 2022/8/214成品E3 计算出E3浓度 周六（全天）上午8：00开始 (1).蔗糖酶米氏常数的测定 (2).用正交法测定几种因素 对蔗糖酶 活力的影响 2022/8/215四、操作步骤及注意事项 1、 DNS比色定糖法工作曲线的制作取11支血糖管编号111，按下页表中的顺序和数量加入葡萄糖标准溶液（0.2%）、蒸馏水、3，5-二硝基水杨酸试剂，混匀后同时放入沸水浴中准确反应5分钟（注意：一定等沸水浴锅中的水沸腾后再放入试管，且不要用大玻璃杯代替沸水浴锅；用秒表记时），取出后立即用流动的冷水冷却，加蒸馏水定容至25ml，摇匀，测定540nm处的A值。以葡萄糖(mg)含量为横坐标、A

9、540值为纵坐标，画出工作曲线。2022/8/216 3，5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作试号 含糖量 葡萄糖标准液 去离子水 3，5-二硝基水杨酸试剂 A540 （mg） （ml） （ml） （ ml） 1 0 0 2.0 3 2 0.4 0.2 1.8 3 3 0.8 0.4 1.6 3 4 1.2 0.6 1.4 3 5 1.6 0.8 1.2 3 6 2.0 1.0 1.0 3 7 2.4 1.2 0.8 3 8 2.8 1.4 0.6 3 9 3.2 1.6 0.4 3 10 3.6 1.8 0.2 3 11 4.0 2.0 0 3 2022/8/217 2、Folin-酚法

10、测定蛋白质含量工作曲线的制作 取7支试管（干燥）按下表中顺序加入各种试剂并进行反应和测定 以1号管为参比调零，记录光密度值A650，以标准液的浓度为横坐 标， A650值为纵坐标，画出工作曲线。 2022/8/218* Folin-酚法测定蛋白质含量的方法1.样品的测定：取两支试管（平行）各加入样品液（稀 释成一定浓度的）1ml ，其他操作（反应和比色测 定）同工作曲线的制作（前页）2.蛋白质浓度的计算： A650值对应的g数(Pr)10-3 Pr (mg/ml)= 稀释倍数 Pr溶液的ml数 2022/8/219 *制作工作曲线的注意事项1.分光光度计的使用：1）测样时,光吸收值A应在0.1

11、000.700之间，并小于标准曲 线的最大值，否则，缩小or加大样品的稀释倍数，重测！ 2）其他，见（523室）操作规程；2.比色杯的使用： 1).洗净（洗净的标准是：透明、无痕迹、不挂水珠）后，置 小烧杯内用蒸馏水浸没； 2).用蒸馏水or buffer校正（方法在仪器室讲），然后在杯 底标上记号（0、1、2、3）； 3).向杯中加样液时，按浓度从低到高的顺序加，注意加样到 比色杯的2/3处； 4).如样液有外溢，先用滤纸条吸干（不许檫）；再用镜头纸 向一个方向檫至透明； 5).将装有参比、样品溶液的比色杯放入比色杯架上时，要摆 放在一条直线上；2022/8/220 6).倒出液体后，一定要

12、用洗瓶中的蒸馏水洗净，然后倒置在滤纸 上吸干； 7).任何情况下都不许把比色杯放在仪器盖上； 8).自备废液杯（盛废液及废纸块用）； 9).各台分光光度计的比色杯是配套的，不许随意调换使用。3.工作曲线的制作（以Folin-酚法测定蛋白质含量的工作曲线为例） 1）反应： 取液量准确：移液管洗净、标号、润洗，最好同一人取样； 温度准确：（恒温水浴中放有温度计），记时准确（用秒表）； 所用的标准液、buffer、反应液应是同一批配制的； 加入Folin-乙试剂时要特别小心！因为Folin-乙试剂只有在酸 性条件下稳定，而反应是在碱性溶液中进行，所以加入Folin- 乙试剂后，一定要迅速摇匀（加一管

13、摇一管）；2022/8/2212）测量： 由同一个人读数； 制作标准曲线及测量样品使用同一台仪器；3）记录： 实验记录本记录要清晰（不许用纸片），实验结束后要 请教师签字； 记录仪器使用情况。4）制图： 标明：曲线名称、纵横坐标的单位、仪器号、使用时间； 注意实验点的分布、大小（依据误差）、直线的角度 （最好在45度左右）； 不许延长工作曲线（比耳定律适用于稀溶液中的反应）。附：标准液的配制： 浓度必须准确，要注意烘干、称量、定容等操作； 分装or取液时防止被稀释！2022/8/2223、 蔗糖酶粗品（E1）的制备 自溶：15g（一小袋）高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中、少量多次地 加入50

14、ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙 酯，搅匀，再于35 恒温水浴中搅拌30分钟，观察菌体自溶现象；抽提：补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好，于35 恒温过夜，8000r/min 离心10min，弃沉淀及脂层，得E1（无细胞提取液）； 量体积V1=（ ）ml（取出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力 及蛋白质浓度）。 4、乙醇分级和透析（制E2） 测E1pH、用稀HAC调pH至4.5（注意少量、慢加、搅匀，防止调过）； 第一次乙醇分级（32%乙醇饱和度）： 计算出使E1的乙醇浓度达32%时，所需95%乙醇的体积X1，将E1和乙醇X1，放入冰盐浴中预冷，在不断搅拌下，

15、缓慢滴加乙醇，3000r/min，离心5min，弃沉淀，留上清； 2022/8/223 第二次乙醇分级（47.5%乙醇饱和度）： 同上法加入X2（为达47.5%乙醇饱和度时需要补加的95%乙醇的体积），离心3min，弃上清，沉淀立刻用10ml 0.005mol/L pH6.0的磷酸buffer溶解，并装入透析带（截止分子量一万的），对上述buffer透析过夜；次日，3000r/min离心3min，得E2，量体积V2=（ ）ml（留出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力及蛋白质浓度），其他酶液准备上样。5. 柱层析（制E3） 装柱：本实验使用的层析柱是自加工的，用泡沫海绵为筛板。装入纤维素前

16、，先把柱内装满起始缓冲液，用玻璃棒挤压海绵,赶尽气泡并把柱子垂直固定；将纤维素用起始缓冲液调稀、搅允后加入，柱内的纤维素应非常均匀地分布，防止出现节面和气泡，床面要平整，床高距柱顶23cm为宜；用起始缓冲液洗柱,控制好流速（防止流干），于4平衡过夜。2022/8/224 上样：次日，将柱中的缓冲液逐渐放出，当顶部液面达到近于柱床表面时，开始用细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样E2，待样液达2cm后再在柱中间小心加样，注意控制流速，使流出液的流出速度为1ml/min左右。 洗柱：样品全部进入床面后，用5倍柱体积的起始缓冲液流过层析柱，洗出未吸附的物质，此时应目测酶活力，检查流出液中是否有酶活力存在（即

17、目的酶是否挂在纤维素上）。 洗脱：因梯度洗脱装置不齐，本实验用阶段洗脱进行。用含0.15mol/LNaCl的 0.005mol/L pH6.0的磷酸缓冲液100ml，控制流速为1ml/min ,用小试管收集，3ml/每管。 收集酶活力峰：每隔一管目测酶活力，确定酶活力峰的位置，合并酶活力峰,得进一步提纯的E3，量出E3的体积V3=（ ）ml（留出2ml置于冷处或冰盐浴中保存，待测酶活力及蛋白质浓度），其它酶液封好、记名，于4保存，留反应动力学性质实验使用。 2022/8/2256、蔗糖酶活力及蛋白质含量的测定 （一）、蔗糖酶活力的测定： 1. 蔗糖酶活力的规定：在本实验条件下，每3分钟释放1毫

18、克还原糖所需 的酶量定义为一个活力单位。 2操作：取两支试管分别加入用pH4.6,0.2mol/L的醋酸缓冲液适当稀释 过的酶液2ml，一支中加入0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，使酶失活（做 对照），另一支做测定管；把两支试管和5%的蔗糖溶液放入35水浴 中预热恒温；分别取2ml 5%的蔗糖加入上述两试管中，并准确计算时 间，3分钟后于测定管中加入 0.5ml 1mol/L的NaOH，摇匀，终止反应 3 .从反应混合物中取出0.5ml溶液放入血糖管中，加入3ml 3,5 二硝基 水扬酸试剂和1.5ml水，摇匀。于沸水浴中准确反应5min，立即用冷水 冷却，加水稀释至25ml，摇匀，于

19、540nm处测光密度。 4. 在葡萄糖标准曲线上找到所测定光密度值对应的葡萄糖含量，按下面 公式计算酶活力： 蔗糖酶活力单位=葡萄糖毫克数9酶的稀释倍数2022/8/226 （二）、目测酶活力的方法：1. 洗柱时用的目测酶活力方法：取两支试管，各加入1ml 5%蔗糖液，然后于一支中加入1ml起始缓冲液，另一支中加1ml洗柱流出液，同时于35恒温水浴中进行水解反应3min，然后各加DNS 试剂1ml ，于沸水浴中反应5min ，比较两支试管颜色的深浅；2. 收集酶活力峰时用的目测酶活力方法：于收集管（每隔一管）中取0.1mlE液+1ml 5%蔗糖液，于35水解反应3min后，加0.2ml 1mo

20、l/L NaOH终止反应，然后加DNS 试剂1ml ，于沸水浴中准确反应5min ，比较各管颜色的深浅，再加密实验点，重复测定，确定酶活力峰的位置。 （三）、三种蔗糖酶（E1、E2 、E3）蛋白质浓度的测定：用 Folin-酚法 测定。 2022/8/227 五、结果及数据处理 1.洗脱曲线 蛋 白 酶 质 活 含 力 量 管号2.原始数据 2022/8/228 3.数据处理 有关计算 1）E=葡萄糖mg数（4.5/0.5）E的的稀释倍数/2ml =（ ）u/ml 2）总活力：EV 3）Pr：查标准曲线 4）总Pr量：PrV 5）比活力：E/Pr or 总活力/总Pr量 6）阶段收率：E2活力

21、/E1活力、E3活力/E2活力 7）总收率：E3总活力/E1总活力 8）提纯倍数：比活力n/比活力n-1 n=1，2，3 将计算出的数据添入下表中：2022/8/2294.实验结果表蔗糖酶酶样品EEE酶浓度总活力蛋白浓度总蛋白量比活力提纯倍数阶段收率总收率（ml）（u/ml）（u）（mg/ml） （mg） （u/mg） （%） （%）样品体积2022/8/230 六、主要参考资料 1、李建武 主编 .生物化学实验原理和方法 . 北京大学出版社 .1994 该书中的：p36-46 （离子交换层析法） 2、沈同 王镜岩主编 .生物化学 第二版 上册 高等教育出版社 .1993 该书中的：p 209

22、、 210、215、216、220中有关论述 3、张树政 主编 .酶制剂工业 上册 .科学出版 社 .19982022/8/231 七、思考题 1） 指出有机溶剂分级沉淀法的原理及操作中 的注意事项。 2） 说明离子交换柱层析的原理及装好层析柱 的具体要求。3） 比较线性梯度洗脱与阶段洗脱的区别。4） 分别指出判断酶损失程度和酶提纯方法优 劣的标志。2022/8/232其 它1） 这个实验较大，涉及到的理论知识和实验技术都较多，用的时间也很长，要求同学们一定做好预习，写好预习报告（方式不限，但一定要写在本子上，并留出记录实验数据和实验现象的位置），否则将严重影响实验进度！2） 你们年级的理论课

23、还没讲到酶学部分，预习时可以看实验课教材（我在编写时已经进行了整理和补充）,但教材中有印刷错误,应以该课件为准.3） 本实验从一开始，就要纵观全局，在各个环节都要注意防止酶失活；只要时间允许，一定要用测定酶活力的方法跟踪酶的去向；4） 实验制品E3要保留！酶促反应动力学性质实验用。2022/8/233蔗糖酶米氏常数的测定 一、目的要求：了解底物浓度与酶反应速度之间的关系，学习蔗糖酶米 氏常 数的测定方法。二、实验原理：米氏常数Km等于酶反应速度达最大反应速度一半时的底 物浓度，单位是mol/L 。对于某一种特定的酶，在特定的反应条件 下，对应任何一种底物（如果它具有多个底物），它的米氏常数 K

24、m是一个定值。在一个反应中，底物的浓度（S）是可以控制的，反 应的速度（V）可以测出，这样就可根据底物的浓度和反应的速度求 出该酶在本实验条件下的米氏常数。通常可以通过以下几种方法求 出Km值： 1）直接将数据代入米氏方程。 2）Lineweaver-Burk双倒数作图法（本实验采用该法），横轴的截距 为：-1/Km。 3）Hanes-Woolf作图法，横轴的截距为：-Km。 4）Woolf-Anguseinsson-Hoftee作图法，斜率为：-Km。 5）Eadie-Scatchard作图法，斜率为-1/Km。2022/8/234三、操作方法：1.取试管8支，按0、1-7编号，0为空白。2

25、.按表1将蔗糖液、醋酸缓冲液分别加入试管中，于35 水浴中保温（使温度平衡，以下同）10min。3.取约20ml酶液，放入同一水浴中保温约10min。4.于各管中依次按同样时间间隔加入已保温过的酶液2ml， 记时，立即摇匀。在35水浴中准确反应3min。5.按同样次序和时间间隔，加入0.5ml的1mol/L NaOH，摇匀 ，终止反应。6.吸取反应混合物0.5ml，加入盛有1.5ml DNS试剂和1.5ml 去离子水的血糖管中，放入沸水中加热5min，冷却后稀释 定容至25ml，摇匀后，测定A540值。2022/8/235表1 Km值的测定 2022/8/236四 数据处理： 以A值作为相对反

26、应速度，以1/S为横坐标，1/A为纵坐标作图，由图求出Km值。五、思考题： 1.说明米氏常数的物理意义及单位？ 2.用双倒数法测定Km值时，应注意的主要问题是什么？ 2022/8/237用正交法测定几种因素对蔗糖酶活力的影响一、目的要求 1.初步掌握正交实验设计方法的使用； 2.求出蔗糖酶的最适温度和最适pH值。二、实验原理 1. 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如：底物浓度、酶浓度、溶液的pH值和离子浓度、温度、抑制剂和激活剂等都能影响催化反应的速度。通常是在其他因素恒定的条件下，通过对某因素在一系列变化条件下的酶活性测定，求得该因素对酶活力的影响，这是单因素的简单比较

27、法。本实验使用正交实验设计法测定温度、pH值、和离子浓度三种因素对蔗糖酶活性的影响，这是多因素（3）的实验方法。 2022/8/238 正交法是通过正交表安排多因素实验，利用统计数学原理进行数据分析的一种科学方法，它符合“以尽量少的试验，获得足够的、有效的信息”的实验设计原则。 2. 本实验以自制的蔗糖酶（E3）为测定对象。蔗糖酶是一种水解酶，可使蔗糖水解为D-果糖和D-葡萄糖。 酶活性的测定，是利用DNS试剂与D-葡萄糖共热后生成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，葡萄糖的量和反应液的颜色呈比例关系，利用比色法可测得酶促反应后生成的还原糖量。2022/8/239三、操作方法 1.实验设计： 1

28、）确定指标：即实验的结果。本实验的指标是酶活力。这里，用A540值表示，能落在葡萄糖工作曲线范围内的A540值越高，指标越好。 2）制定因素水平表：考察三个因素（温度、pH值和离子浓度），每个因素取三个水平。水平是因素变化的范围（通常是根据专业知识确定。如无资料可借鉴，应先加宽范围再逐步缩小）内要进行实验的具体条件，如表1。 2022/8/240 表1 因素水平表 2022/8/241 3）选择正交表：可容纳三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（366）和L27（389）。本实验不考察各因素间的交互作用，也没设计混合水平，只有水平数均为3的的三个因素，故选用L9（34）

29、表，见表2。 按一般的实验方法： 简单比较法（最常用），因实验点分配不均衡，易把好条件漏掉，又因数据无规律而对结果无法进行分析和判断。 全面实验法：（即对三个因素三个水平的各种搭配都考察）要进行33=27次实验。而用正交表L9（34），只做九次实验，就可以找到好的实验条件。 2022/8/242而且，还可以进行如下分析：A. 判断各因素的水平范围是否选偏；B. 判断各因素显著性大小的顺序；C. 判断实验结果的置信度。 由表2可见，正交表L9（34）有任何正交表都具有的如下特点： A .任何一列各水平出现的次数相等，该表均为3次。2022/8/243 表2 正交表L9（34） 2022/8/24

30、4 B. 任何两列横行组成的数字对出现的次数都相等。该表有9个数字对，即（1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、（2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3）都出现一次。 C. 任何两列同名数对出现的次数都相等。该表中有3个同名数对，即（1，1）、（2，2）、（3，3），均出现一次。 以上特点，保证了用正交表安排的实验计划是均衡搭配的，因此可以进行综合比较和方差分析。 4）安排实验：将本实验的三个因素分别放在L9（34）表的第1、2、3列中，再将各列的水平数用该因素相应的水平写出来，即得到实验安排表，见表4的上半部分。2022/8/2452. 具体操作步骤： 1）将已配制好

31、的三种不同pH的0.2mol/L的缓冲液于 9支试管中按表3进一步稀释至一定浓度。表3 三种不同pH buffer的稀释表2022/8/246 2）另取18支试管，编号19及1-9（平行组），按表4中2、3列的要求，分别加入上述不同pH不同浓度的缓冲液2ml及蔗糖酶液（浓度15U/ml左右）1ml，混匀。 3）按表4中第一列的要求，将19及1-9试管分别放入相应温度的恒温水浴中保温10min。 4）另取足量的0.2mol/L蔗糖液三份，分别置于20、35、50水浴中保温5min。 5）向19及1-9试管中，依次间隔1min（或2min）加入相同温度下保温过的0.2mol/L蔗糖液1ml，立即记时，摇匀，放回原来温度的水浴中，准确反应3min。 6）按上述次序和时间间隔，加入1mol/L NaOH液0.5ml，摇匀。 7）空白管：另取一支“0”号试管，加入15U/ml酶液1ml，1mol/LNaOH液0.5ml，摇匀，再加入0.2mol/L蔗糖液1ml及去离子水2ml。 8）分别于各管中吸取反应物0.5ml，加入对应编号的盛有3mlDNS试剂的血糖管中，放入沸水浴中加热（要用铜水浴锅，一定保持沸腾），准确反应5min，急速水冷后，稀释至25ml，摇匀。以空白管为参比，测出