免疫组化实验报告

1、免疫组化一、实验目的：1.了解免疫组化基本原理。2.了解免疫组化实验操作及注意事项。3.免疫组化结果判定。通过实验，让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项，对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献，在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。二、实验原理：三、实验材料：一抗： Ki67、PCNA、VEGF、TGE-、AFP等二抗：兔HRP标记抗体其它：组织切片、EDTA抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶，孵育盒。四、实验步骤：1.组织切片脱蜡水化二甲苯()10min，二甲苯()10min，无水

2、乙醇()3min，无水乙醇()3min，95%酒精3min，85%酒精3min，自来水冲洗。2.抗原修复采用EDTA修复，具体步骤见修复方法。3.过氧化物酶阻断 修复结束后，流水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体，滴加50 L（一滴） 过氧化物酶阻断剂，室温孵育10min，PBS冲洗33min。4.孵一抗甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 L（一滴）相应一抗，37孵育60min或4过夜，PBS冲洗33min。5.孵二抗甩去PBS，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 L（一滴）二抗试剂，37下孵育30分钟，PB

3、S冲洗33min。6.DAB显色甩去PBS液，纸巾擦干组织3mm外的残留液体，每张切片加50 L（一滴）新鲜配制的DAB，显色5min，自来水冲洗。7.苏木素复染每张切片滴加50 L（一滴）苏木素，10-15s后自来水冲洗，或浸泡于PBS中10-15s再自来水冲洗。8.封片梯度酒精脱水干燥（85%酒精2min，95%酒精2min，无水乙醇2min，无水乙醇2min，二甲苯1min），或直接烘箱烘干，中性树胶封固。修复方法一、EDTA水煮修复法取500ml EDTA抗原修复液于1000ml不锈钢锅中，加热至沸腾，将电磁炉功率调至保温状态（120W），使修复液保持微沸状态。将脱蜡水化后的切片置于耐

4、高温染色架上，再将染色架缓慢放入不锈钢锅中（注意：若快速放入可能会导致组织脱落），之后加盖继续加热20分钟。再将不锈钢锅从电磁炉上移开，室温冷却10分钟后用自来水冲淋不锈钢锅外壁加速冷却至室温，取出玻片，自来水冲洗干净，除去自来水，在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈，PBS冲洗2次，每次3分钟。本次实验采取的是EDTA水煮修复法。注意事项：1、加热时间长短（20分钟）和加热功率（120W）的控制很重要2、修复液不能重复使用。3、工作液的量必须保证切片始终能浸泡在液体内。4、为防止组织脱落，必须使用防脱玻片。5、抗原修复后一定要等修复液冷却后，才能将切片取出。五、实验结果与分析：图一癌变细胞免疫

5、组化显微镜200倍视图图二癌变细胞免疫组化显微镜400倍视图图三正常细胞免疫组化显微镜400倍视图（其他组的）这次实验本小组选做的是癌变细胞的免疫组化，运用的一抗为Ki67，二抗为兔HRP标记抗体，Ki-67是一种核蛋白，与核糖体RNA转录有关。Ki-67的失活核糖体RNA合成受限。可以作为一个细胞增殖的标记物。Ki-67在细胞增殖的各期(G1，S，G2和M)中均有表达，但在细胞静止期G0期不表达。在病理报告中的指数高低与许多肿瘤分化程度、浸润、转移及预后密切相关。所以观察实验结果，可以发现标记的部位为细胞核，被标记的的细胞可清晰的观察到细胞核形态。图一、图二是本组实验得出的癌变细胞免疫组化分别在200倍和400倍的图片，图三是其他组得出的正常细胞免疫组化400倍的图片，可以观察到正常细胞细胞核紧密，形状近圆形，而癌变细胞细胞核形状不规则，且细胞核松散，缝隙较大。六、心得体会之前在学习细胞生物学课本时，看到免疫组化技术，一直认为这是一项及其复杂的技术，直到本次实验操作起来才发现并没有想象中困难，虽过程繁