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文档简介
1、免疫组化一、实验目的:1.了解免疫组化基本原理。2.了解免疫组化实验操作及注意事项。3.免疫组化结果判定。通过实验,让学生熟悉免疫组化操作流程及注意事项,对抗原抗体结合、抗原修复和酶催化底物显色进行研究。要求学生通过查阅文献,在归纳、对比、总结的基础上对免疫组化有进一步的了解。二、实验原理:三、实验材料:一抗: Ki67、PCNA、VEGF、TGE-、AFP等二抗:兔HRP标记抗体其它:组织切片、EDTA抗原修复液、过氧化物酶阻断剂、PBS缓冲液、DAB、孵育盒、染色架、苏木素、盖玻片、冲洗瓶、中性树胶,孵育盒。四、实验步骤:1.组织切片脱蜡水化二甲苯()10min,二甲苯()10min,无水
2、乙醇()3min,无水乙醇()3min,95%酒精3min,85%酒精3min,自来水冲洗。2.抗原修复采用EDTA修复,具体步骤见修复方法。3.过氧化物酶阻断 修复结束后,流水冲洗干净,除去自来水,在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈或用纸巾擦干组织外残留的液体,滴加50 L(一滴) 过氧化物酶阻断剂,室温孵育10min,PBS冲洗33min。4.孵一抗甩去PBS,纸巾擦干组织3mm外的残留液体,每张切片加50 L(一滴)相应一抗,37孵育60min或4过夜,PBS冲洗33min。5.孵二抗甩去PBS,纸巾擦干组织3mm外的残留液体,每张切片加50 L(一滴)二抗试剂,37下孵育30分钟,PB
3、S冲洗33min。6.DAB显色甩去PBS液,纸巾擦干组织3mm外的残留液体,每张切片加50 L(一滴)新鲜配制的DAB,显色5min,自来水冲洗。7.苏木素复染每张切片滴加50 L(一滴)苏木素,10-15s后自来水冲洗,或浸泡于PBS中10-15s再自来水冲洗。8.封片梯度酒精脱水干燥(85%酒精2min,95%酒精2min,无水乙醇2min,无水乙醇2min,二甲苯1min),或直接烘箱烘干,中性树胶封固。修复方法一、EDTA水煮修复法取500ml EDTA抗原修复液于1000ml不锈钢锅中,加热至沸腾,将电磁炉功率调至保温状态(120W),使修复液保持微沸状态。将脱蜡水化后的切片置于耐
4、高温染色架上,再将染色架缓慢放入不锈钢锅中(注意:若快速放入可能会导致组织脱落),之后加盖继续加热20分钟。再将不锈钢锅从电磁炉上移开,室温冷却10分钟后用自来水冲淋不锈钢锅外壁加速冷却至室温,取出玻片,自来水冲洗干净,除去自来水,在离组织3mm处用免疫组化油笔画圈,PBS冲洗2次,每次3分钟。本次实验采取的是EDTA水煮修复法。注意事项:1、加热时间长短(20分钟)和加热功率(120W)的控制很重要2、修复液不能重复使用。3、工作液的量必须保证切片始终能浸泡在液体内。4、为防止组织脱落,必须使用防脱玻片。5、抗原修复后一定要等修复液冷却后,才能将切片取出。五、实验结果与分析:图一癌变细胞免疫
5、组化显微镜200倍视图图二癌变细胞免疫组化显微镜400倍视图图三正常细胞免疫组化显微镜400倍视图(其他组的)这次实验本小组选做的是癌变细胞的免疫组化,运用的一抗为Ki67,二抗为兔HRP标记抗体,Ki-67是一种核蛋白,与核糖体RNA转录有关。Ki-67的失活核糖体RNA合成受限。可以作为一个细胞增殖的标记物。Ki-67在细胞增殖的各期(G1,S,G2和M)中均有表达,但在细胞静止期G0期不表达。在病理报告中的指数高低与许多肿瘤分化程度、浸润、转移及预后密切相关。所以观察实验结果,可以发现标记的部位为细胞核,被标记的的细胞可清晰的观察到细胞核形态。图一、图二是本组实验得出的癌变细胞免疫组化分别在200倍和400倍的图片,图三是其他组得出的正常细胞免疫组化400倍的图片,可以观察到正常细胞细胞核紧密,形状近圆形,而癌变细胞细胞核形状不规则,且细胞核松散,缝隙较大。六、心得体会之前在学习细胞生物学课本时,看到免疫组化技术,一直认为这是一项及其复杂的技术,直到本次实验操作起来才发现并没有想象中困难,虽过程繁
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