《细胞生物学技术》课件细胞培养

1、原代培养步骤胎大鼠浸75%酒精置大平皿内消毒背部皮肤取肾脏放小平皿内PBS洗2次剪碎后移入4ml离心管PBS洗2次（洗到组织块发白，洗去血细胞）静置10分钟弃上清加消化液1ml手握消化10分钟静置弃上清加培养液2ml吹打混匀 移入培养皿二氧化碳培养箱培养 结 果ERaMTA1DAPIMerge胎鼠肾脏原代培养72 h 传代培养步骤 HeLa细胞弃上清加1-2ml消化液 倒置显微镜下观察，细胞收缩变圆，细胞间连接打开 弃上清，加10ml培养液，吹打制成细胞悬液 分装2个培养瓶（培养皿），放二氧化碳培养箱培养 无菌操作中的注意事项1.操作前认真洗手并用75%乙醇消毒2.操作前20-30分钟启动超净

2、台紫外消毒灯。3.操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等。4.培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。5.操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。无菌操作中的注意事项6.使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。7.整个无菌操作过程都应该在酒精灯的周围进行。8.禁止双手交叉取物。 9.手臂禁止从开口的瓶口上方经过。细胞的冻存与复苏1.了解冻存与复苏的原理2.熟悉细胞冻存与复苏的方法步骤实验目的 缓慢冻

3、存与快速复苏 当细胞冷到0以下，可以产生以下变化，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，加入保护剂后细胞内的水分在冻结前渗出到细胞外，避免冰晶损伤。细胞的冻存与复苏的原则 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂。 冻存液： 含20%血清培养基和10%DMSO（或10%甘油）低温保护剂的应用的 1.选对数生长期细胞，冻存细胞前24小时换液，按传代方式制成细胞悬液。2.收集细胞，1000rpm，离心5分钟，去上清。3.加冻存液1-1.5ml，轻轻吹打使细胞混悬，移入冻存管，拧紧盖4.标记

4、好名称、日期。5.放入细胞冻存器里，置-80冰箱，长期保存在液氮中。细胞冻存 4.标记好名称、日期。5.放入细胞冻存盒里，置-80冰箱，长期保存在液氮中。细胞冻存 1.从液氮中取出冻存管，迅速投入37-42水浴中，使其融化。2.在超净工作台内，吸出细胞悬液装入培养瓶中，并以10稀释，放CO2培养箱中培养，24h后换液。细胞复苏培养细胞的形态观察和计数1.了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态2.掌握细胞计数的基本方法实验目的 （一）.贴壁生长型细胞 必须贴服在培养支持物上才能生长的细胞，从 形态上大体分为上皮细胞型和成纤维细胞型。（二）.悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长

5、。培养细胞的生长方式和类型 贴壁型细胞ERaMTA1DAPIMerge上皮细胞型细胞成纤维细胞型细胞悬浮型细胞（HL-60）ERaMTA1DAPIMerge ERaMTA1DAPIMerge细胞生长状态良好：细胞质均匀透明，颗粒少，没空泡培养液清澈透明，看不到悬浮的细胞和碎片 细胞污染1.准备计数板 将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上备用。 细胞计数步骤2.制备细胞悬液 以传代的方式制备细胞悬液3.染色 取细胞悬液0.5ml,加入0.3%台盼兰0.5ml，混合 后染色3分钟。4.滴加悬液 将染色后的细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘。 细胞计数步骤5.计数 10倍物镜下观察，计算计