SLE 相关基因 IFIT1 免疫调节功能的初步研究

1、SLE 相干基因 IFIT1 免疫调治成效的开端研究【摘要】目的：研究体系性红斑狼疮SLE相干基因IFIT1的成效。要领：起首将IFIT1从穿梭表达克隆转入真核表达克隆，然后转导进入Jurkat细胞系，用有限稀释法挑选单克隆；再用D3和D28刺激单克隆，检测膜分子的表达、细胞凋亡、增生、细胞因子排泄等免疫生物学指标；末了应用RNAi技能，下调IFIT1的表达，检测细胞因子排泄，比力阐发IFIT1的成效。效果：IFIT1的过分表达在T细胞中能诱导白细胞介素IL-4和IL-10的排泄增长，下调IFIT1的转录程度后能部门下调IL-4和IL-10表达，而与细胞膜分子的表达、细胞的增生、凋亡无关。结论

2、：SLE相干新基因IFIT1在细胞因子的产生中起了紧张作用，大概与Thl/Th2的失衡有关。【关键词】体系性红斑狼疮；IFIT1；细胞因子；基因干预KeyrdsSysteilupuserytheatsus;IFIT1;ytkines;Geneinterfere体系性红斑狼疮SysteiLupusErytheatsus,SLE是由遗传、性激素、熏染、情况等因素彼此作用所致的一种多条理免疫成效非常的自身免疫性疾玻大量研究证明，基因程度的免疫调治停滞及细胞因子代谢紊乱在SLE中表现突出，直接或间接地到场了SLE的形成和产生生长历程。比年来，随着基因阐发技能的不竭生长和相干研究的深化，一些SLE相干基

3、因不竭浮出水面，此中尤以IFIT1备受存眷。有证据表白IFIT1在T细胞经D3/D28激活的信号传导通路中到场了细胞因子合成的调控，在SLE历程中起着举足轻重的作用1，2。本研究拟通过创立不变过表达IFIT1的转染T细胞系，接纳基因干预技能RNAi下调IFIT1的表达，检测有关免疫学指标，进一步阐发IFITI在T细胞中的成效。1质料与要领1.1重要试剂和仪器1.2Jurkat不变转染细胞系的创立1.3免疫生物学成效指标的检测用D3和D28别离刺激克隆细胞株Jurkat、Jurkat/EGFP和JurkaIFIT1-EGFP后，举行以下免疫生物学成效指标的检测。1.4RNAi的开端应用1.5统计

4、学处置惩罚全部资料均以均数尺度差xs表现；差异的明显性查验接纳t查验举行阐发；P0.05作为明显性边界。2效果2.1IFIT1-EGFP不变转染细胞系的创立电转导48h后，经荧光显微镜不雅察到约40%的细胞表达荧光，经G418挑选4周后形成几个克隆细胞株，为验证此中IFIT1的表达程度，应用荧光定量PR法检测细胞株中IFIT1的RNA含量，效果表现Jurkat/IFIT1-EGFP细胞株比Jurkat/EGFP细胞株显着增高，差异有明显统计学意义P0.05表1。2.2细胞膜分子的表达利用均匀荧光强度FI来表现细胞膜分子的表达程度。经流式细胞仪检测，3个细胞株Jurkat、Jurkat/EGFP

5、和Jurkat/IFIT1-EGFP之间，细胞膜分子的表达程度无明显性差异表2。2.3D3和D28刺激后细胞因子程度3个细胞株用D31g/L和D282g/L刺激3d后，检测细胞因子的排泄程度，数据表现Jurkat/IFIT1-EGFP细胞株的细胞因子IL4及IL-10的产量显着高于别的2个细胞株，而IL-2和IFN-在3个细胞株间的变革并不显着表3。2.4地塞米松诱导的细胞凋亡3个细胞株Jurkat、Jurkat/EGFP和Jurkat/IFITl-EGFP流式细胞仪检测，凋亡细胞百分比别离为8.75%、5.02%、6.13%，差异无明显性P0.05。2.5流式细胞仪检测细胞增生程度在加核酸染

6、料SFE后，经D31g/L和D282g/L刺激4d后，用流式细胞仪检测细胞增生程度,效果表白IFIT1对细胞的增生无显着影响。2.6Jurkat/IFIT1-EGFP细胞株下调IFIT1-RNA后细胞因子表达的变革鄙人调IFIT1的RNA后，Jurkat/IFIT1-EGFP细胞株排泄IL-4和IL-10的本领相应落落，与未下调RNA者比拟差异有明显性意义表4。3讨论体系性红斑狼疮SLE是由遗传、性激素、熏染、情况等因素彼此作用引起机体免疫调治紊乱所致的一种自身免疫性疾玻由于细胞和体液免疫成效停滞，产生多种自身抗体，触发机体的免疫病理反响，血清中出现以抗核抗体为代表的多种自身抗体，终极导致多体

7、系多器官成效受损。大量研究3-6证明，免疫调治停滞在SLE中表现突出，大量自身抗体产生和丙种球卵白升高，说明B细胞运动高度活泼；T淋巴细胞绝对量虽淘汰，但T细胞亚群之间的比例普及失调；白介素、IFN-及IFN-等细胞因子的代谢非常等。均提示体液免疫和细胞免疫调控机制的紊乱，直接或间接地到场了SLE的形成和产生生长的各个环节。本工程实行资料提示，在T细胞经D3/D28激活的信号传导通路中，SLE相干基因IFIT1到场了细胞因子合成的调控历程。国表里已有研究以为，SLE存在严峻的免疫调治紊乱，只管SLE的病因未明，但不雅察创造在免疫炎症部位浸润有大量的活化T淋巴细胞，造成局部构造损伤。SLE的免疫

8、构造化学研究表白，在病变的血管和腺体等部位浸润着的重要是D4T淋巴细胞。自身免疫D4T细胞按照细胞因子排泄形式可分为Th1细胞和Th2细胞二个亚群。Thl细胞重要排泄IL-2和IFN-；Th2重要排泄IL-4及IL-l0。前者重要到场促进细胞免疫应答，后者重要到场促进体液免疫应答。Thl细胞因子按捺Th2细胞，反之亦然。Thl细胞能合成IL-2、IFN-、LT、IL-3、TNF-和G-SF，即Thl型细胞因子；Th2能合成TNF-、IL-3、G-SF、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-l3。这些细胞因子在调治免疫、激活分化其他免疫活性细胞、产生信号分子等方面发挥着紧张作用7。正常

9、机体Thl/Th2维持动态网络平衡，当Th1/Th2失调时，即为“Thl-Th2漂移。差异的Th1/Th2具有差异的免疫效应。外洋有学者以为在自身免疫病中Thl/Th2失衡的特点是：器官特异性疾病如多发性硬化和克隆病是以Thl为主的病理免疫反响；而SLE和枯燥综合征那么是以Th2型的细胞因子为主导的免疫非常应答8。IFIT1是IFN诱导的卵白，随着分子生物学和基因信息的富厚和生长，IFIT1的序列和克隆均已便利得到8-10，但是其成效却报道不多。本研究在充实利用已有信息和质料的底子上，创立了IFIT1过表达的Jurkat细胞株，对经D3/D28抗体活化的细胞株举行了几项成效检测，创造IFIT1

10、能促进IL-4和IL-l0这两种细胞因子的排泄，似提示SLE的产生生长与Th2标的目的的细胞因子干系更为严密，这一点另有待进一步的研究。在成效基因组研究中，必要对特定基因举行成效丧失或低落表达，以确定其成效。2001年外洋学者11初次利用2l23bp双链RNA实现了真核细胞中相应基因关闭，称之为小滋扰NasallinterfereneRNA。siRNA可以或许引导相应RNA酶结合到RNA靶序列，使之落解。这种技能即为siRNA技能，也称基因沉默沉静技能genesilene。由于siRNA具有高度的序列埋头性，可以特异地使特定基因沉默沉静，得到成效丧失，它比反义RNA技能和同源共按捺法更有用，因

11、此siRNA可以作为一种强有力的研究东西，研究目的基因的成效，短时间内，该技能就被应用于种种范畴的实行治疗研究中12-13，如抗HIV病毒、HV病毒、抗肿瘤等，成为一种有力的基因干预的本领。然而该研究要领存在必然的范围性，只能下调RNA的表达，而不克不及像基因敲除那样完全阻断基因的表达。因此本研究利用的基因沉默沉静技能只能部门下调IFIT1的RNA的表达，不克不及相识IFIT1完全阻断后的细胞因子排泄的变革合格式。临床上已试用的生物制剂有细胞因子及细胞膜分子的拮抗剂，固然有必然的疗效，但其非特异性和疗效的有限性使得临床大夫急迫渴望更有用、副作用更小的药物。另一方面，迄今为止，狼疮的发病机制研究

12、上未获打破，此中胞内信号传导通路知之甚少。因此，基于IFIT1在信号传导通路中大概的紧张位置及其在T细胞的细胞因子排泄成效中的紧张作用，提示IFIT1是很有潜力的临床药物靶点。自从滋扰素应用于临床治疗以来，常有报道病毒熏染者经滋扰素治疗引起狼疮等自身免疫病的征象，其机制未明l4，因此本研究为探究SLE特定的非常发病通路，阐发发病机制，特异性治疗药物的开拓利用奠基了基矗【参考文献】1YeS,PangH,GuYY,eta1.PrtEininteratinfraninterfern-induiblesysteilupusassiatedgene,IFITIJ.Rheuatlgy(xfrd),2022

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