酶工程考点总结

1、学习必备欢迎下载第一章1，什么是酶？试述酶的化学本质？,酶是生物体内普遍存在的一种具生物催化活性的蛋白质（或核酸）能在不改变化学反应平衡点的条件下大大降低反应的活化能,从而使化学反应能够在常温常压下迅速高效地进行.2，酶促反应速度的概念，表示方法（底物消耗，产物生成），影响酶促反应的因素（至少4种）？酶催化反应的速率称作酶速度；酶促反应速度就是用一定时间内底物减少或产物生成的量来表示反应的进程。影响酶促反应的因素：pH、温度、激活剂、抑制剂3，写出米氏酶促反应动力学方程并说明其含义.Km值有何物理意义?如何测量Km值和Vmax值?v=oVmaxSKm+SKm值物理意义：（1）km是酶的一个基本

2、的特征常数。其大小与酶的浓度无关，而与具体的底物有关，且随着温度、pH和离子强度而改变。（2）从km可判断酶的专一性和天然底物。Km最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。（3）当k2k3时，km的大小可以表示酶与底物的亲和性。（4）从km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。（5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径。测量Km值和Vmax值的方法：米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从v与S的关系曲线求得V，然后再从1/2V求得相应的S即为Km（近似值）。学习必备欢迎下载，4，充分理解酶的不可逆抑制,可逆抑制(竞争性、非竞争性、

3、反竞争性）理解在上述抑制过程中Km和Vmax的变化不可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的。通常是与靠近活性部位的氨基酸残基形成共价键，永久地使酶失活。可逆抑制作用：抑制剂与酶的结合是可逆的。抑制程度是由酶与抑制剂之间的亲和力大小、抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。竞争性抑制作用：抑制剂和底物竞争与酶结合。（特点：1）抑制剂和底物竞争酶的结合部位2）抑制程度取决于I和S的浓度以及与酶结合的亲和力大小。3）竞争性抑制剂的结构与底物结构十分相似。第一幅图）非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。图一图二5，结合物质代谢过程中举例说明别构酶的概念？有

4、些酶具有类似血红蛋白那样的别构效应，称为别构酶。6，正确理解酶活性单位的概念。什么是酶的国际单位及其定义？(不能用考马斯亮蓝，因为不能测量目标蛋白的含量)酶活力是指酶催化某一化学反应的能力。酶（活力）单位：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。U/g，U/ml）国际单位:在最适的反应条件（25）下，每分钟内催化一微摩尔底物转化为产物的酶量定为一个酶活力单位，即1IU=1mol/min7，酶的纯度的概念及测量酶的纯度的方法？酶的纯度：单位蛋白中所含的活力单位数，比活力=活力单位数/毫克蛋白（氮）学习必备欢迎下载酶的纯化鉴定：聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法8，分离提纯技

5、术手段？在酶的分离提纯过程中主要技术指标是什么？（理解）纯化技术：凝胶过滤、离子交换、色谱聚焦、疏水作用、亲和分离、反相等书本20页，这题的知识有点散乱，所以大家有兴趣在看看，这题答案不确定9，酶活性中心,必需氨基酸,反应活化能,单纯酶,全酶(结合酶),辅酶,辅基,单体酶,寡聚酶,多酶复合体,同工酶,酶原激活酶活性中心：存在于酶分子表面的具有结合和催化底物形成产物的空间区域；包括结合基团和催化基团。必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。(必需氨基酸?)必需氨基酸：反应活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol反应物全部进入活化状态所需的自由能。单纯

6、酶：全酶：（结合酶）=酶蛋白+辅因子辅酶：与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。辅基：与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。单体酶（monomericenzyme)：仅有一条具有活性部位的多肽链，全部参与水解反应。寡聚酶(oligomericenzyme)：由几个或多个亚基组成，亚基牢固地联在一起，单个亚基没有催化活性。亚基之间以非共价键结合。多酶复合物(multienzymesystem)：几个酶镶嵌而成的复合物。这些酶催化将底物转化为产物的一系列顺序反应。同工酶：能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。酶原的激活：没有活性的酶的前体称为酶原。酶

7、原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。10，试述国际酶学委员会关于酶的分类及命名的原则,国际酶编号的含义及表述.分几大类?分6大类：1。氧化还原酶类；2.转移酶；3.水解酶；4.裂合酶；5.异构酶；6.连接酶（合成酶）酶的编号(每种酶都有其唯一的独特的编号,可以看出酶的基本性质)：统一表示为：(EC数字1.数字2.数字3.数字4)，其中EC:EnzymeCommission(酶学委员会)如:乳酸脱氢酶(乳酸:NAD:氧化还原酶(EC1.1.1.27),表示该酶为第一大类(氧化还原酶类),属其中的第一亚类(作用于CH-OH基团),同时表示该酶属第一亚-亚类(表示其受体是NAD+或NADP+)学

8、习必备欢迎下载第二章11，固定化酶活力概念（注：限制酶的活动空间，不是固体化）固定化酶的概念：在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以回收使用.(不一定是固体)固定化：利用一定措施将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。12，固定化酶与游离酶相比较的优势?固定化酶的优势：极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应酶反应过程能够加以严格控制；较游离酶更适合于多酶反应；在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；可以增加产物的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高

9、、成本降低。固定化酶的缺点：固定化时，酶的活力有损失；只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；增加了生产的成本，工厂初始投资大；与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；胞内酶必须经过酶的分离手续13，评价固定化好坏的指标（偶联率，相对活力，活力回收，半衰期）偶联率，是中间指标，表示酶被固定化的程度的高低相对活力，实际体现出的酶活占理论酶活的百分比活力回收，终端指标，可以体现固定化工艺的好坏。半衰期，是评定固定化酶稳定性的指标。14，为什么固定化酶在一般情况下会比游离酶更加稳定？固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子的伸展变形（空间自由度受限，刚性增

10、加，空间结构不易变-稳定）酶活力的缓慢释放。当酶与固态载体结合后，失去了分子间相互作用的机会，从而抑制了酶的降解15，固定化酶的性质发生变化体现在？米氏常数值的变化（见课本）性质变化体现：酶活力一般都下降，稳定性一般上升，最适pH改变（附：最适温度提高）（固定化酶的表观随载体的带电性能变化：表观Km值指的是测出来的Km值,不一定是实际的.比如包埋后的酶可能性质不变,但Km会由于传质效应而测出来上升,这时由于酶的性质不变,实际上km是不变的.）16，固定化共价固定的活化基团方法举例?载体上常用的功能基团包括:芳香氨基,羟基，羧甲基，氨基等可以与载体结合的酶的功能基团包括：氨基，羧基，巯基，羟基，

11、咪唑基，酚基等17，酶的固定化方法主要有：共价结合固定法，和非共价结合法。学习必备欢迎下载非共价结合法包括：结晶法；分散法；物理吸附法；离子结合法共价结合法：主要有二种将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应；在载体上接上一个双功能基团，然后将酶偶联上去。活化载体的方法：重氮偶联法;溴化氰法18，交联法属于共价结合法，但无载体，最常使用的交联剂是：戊二醛。第三章19，化学修饰:凡通过化学基团的引入或除去,而使蛋白质共价结构发生改变,称为蛋白质的化学修饰.选择性化学修饰:利用化学试剂对肽链特定的基团的专一性修饰,称为选择性化学修饰。亲和修饰：修饰剂与底物有相类似的结构,对酶活性部位具有高

12、度的专一性,能对活性部位的氨基酸残基进行共价标记,这类专一性化学修饰称为亲和化学修饰。亲和试剂应具有的特性:在使酶不可逆地失活前,亲和试剂要和酶形成可逆复合物;亲和试剂的修饰程度是有限的;没有反应的竞争性配体的存在应减弱亲和试剂的反应速度;亲和试剂的体积不能太大,否则会产生空间障碍;修饰产物应该稳定,便于表征和定量.20，如何控制酶修饰反应的专一性？a)依赖修饰的目的选择合适的化学修饰剂（举一两个例子）一般地要考虑以下问题：i.修饰反应要完成的程度；ii.对个别氨基酸残基是否专一；iii.在反应条件下，修饰反应有没有限度；iv.修饰后蛋白质的构象是否基本保持不变；v.是否需要分离修饰后的衍生物

13、；vi.反应是否需要可逆；vii.是否适合建立快速方便的分析方法。b)反应条件的选择（举一两个例子）原则：允许修饰反应能顺利进行，同时不造成蛋白质的不可逆变性，有利于专一性地修饰蛋白质。因此对反应的温度、pH值、反应介质、缓冲液等都要根据以上原则进行考虑。21，大分子化学修饰的优点：稳定性提高，体内半衰期延长，免疫原性和毒性降低或消除，提高膜渗透性，提高疗效，增加在有机溶剂中的溶解度和耐有机溶剂变性的能力。22，举例分析为什么要进行酶的化学修饰？适当的化学修饰是提高酶稳定性、解除其抗原性、改变酶学性质（最适pH、最适温度、Km值、催化活性和专一性）的一种重要手段。23，简述酶的主要功能基团的修

14、饰方法,记住每一种功能基团的修饰方法中的典型的一种,特别是有特征性光谱变化的一些基团修饰剂？（主要类型，主要修饰方法和修饰剂）24，酶修饰的程度和部位的测定？分析方法：光谱法（最简单，最有效）；间接法（最常用）学习必备欢迎下载25，修饰对酶的性质的影响（是一般，不是一定）？提高生物活性；增强稳定性；减少免疫原性；产生新的催化能力。第四章?26，什么叫蛋白质的稳定性?如何理解蛋白质的稳定性这个概念?影响蛋白质稳定性的主要因素有哪些?如何理解疏水性与蛋白质稳定性的关系（疏水键内部规则排列越高，稳定性越高）蛋白质的稳定性:蛋白质抵抗各种因素的影响,保持其生物活力的能力.维持蛋白结构稳定的主要因素:金

15、属离子、底物、辅因子和其他相对低分子质量配体的结合作用蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用盐桥和氢键二硫键对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低氨基酸残基的坚实装配疏水相互作用疏水性与蛋白质稳定性的关系疏水性大小与稳定性没有必然的联系非极性氨基酸在蛋白质球体内的规则的排列是稳定性的原因之一增加疏水作用是稳定蛋白质的实用方法:降低蛋白质表面的疏水性,增加蛋白质内部的疏水性27，蛋白质稳定性的指标?热稳定性的衡量标准和稳定性的最有效指标是什么?（半衰期，熔化温度，变性剂浓度）指标包括熔化温度Tm、蛋白质自由能、最大稳定性温度、在特定条件下蛋白质功能活性维持的时间；其中最有效指标Tm、变性剂浓度28，蛋白质失活

16、有哪些可能的原因和机理?蛋白质水解酶和自溶作用：体外蛋白水解作用，催化肽键水解，当蛋白质底物也是蛋白水解酶时就会发生自我降解现象，即自溶；聚合作用：蛋白质首先发生可逆性伸展,伸展的蛋白质分子彼此缔合,以最大限度减少疏水氨基酸暴露于水溶剂,最后可能发生蛋白质分子间二硫键的形成,从而使蛋白质沉淀析出.蛋白质的聚合作用可能是不可逆的,并不一定是不可逆的.极端pH：pH的变化可以引起蛋白质的伸展,这个过程原则上是可逆的,但这些变化常能导致不可逆的聚合或酶的自溶,引起不可逆失活.氧化作用、表面活性和去污剂、变性剂、重金属离子和巯基试剂、热、机械力、冷冻和脱水，辐射作用29，从固定化和修饰的角度讨论酶的稳

17、定化策略.固定化通过空间障碍，机械方式两个因素来达到酶的稳定化；空间障碍即由于空间障碍可以防止蛋白水解酶的作用，阻挡酶与化学失活剂的接触，同时阻碍氧向酶的扩散可以保护对氧不稳定的酶。机械方式使酶发生交联或包埋在载体紧密的孔中可以使酶的构象更加坚牢，从而阻止酶构象从折叠态向伸展态过渡。修饰使酶构象坚固化，修饰可增加、中和或改变酶分子上的带电残基，可溶性大分子的连接抑制与其他溶质（蛋白酶）的相互作用，从而达到酶的稳定化。学习必备欢迎下载第五章27，有机溶剂中酶的催化活性和选择性与什么因素有关?(至少指出4种因素)系统的含水量、有机溶剂性质、酶的状态（固定化、游离、化学修饰、干粉等）、环境pH值等密

18、切相关酶在非水介质中酶结构及功能的关系如何变化?答：酶的结构的改变使酶功能发生相应的改变。酶分子结构动态变化：酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和一定的柔性发挥催化功能；在含微量水（1%）的有机溶剂中,与蛋白质分子形成分子间氢键的水极少,蛋白质分子内氢键起主导作用,导致蛋白质变得“刚硬”，活动的自由度变小，限制了疏水环境下蛋白质构象向热力学稳定状态的变化。导致：酶的活力发生改变：一般能够较好的保持，但部分酶会失活由于有机溶剂中缺少使酶失活的水分子,由水引起的酶分子中天冬酰胺脱氨基作用,天冬氨酸肽键水解,二硫键破坏,半胱氨酸氧化及脯氨酸和甘氨酸的异构化等蛋白质热失活过程全都难以进行导致：有机溶剂

19、中酶的热稳定性和储存性都比水溶液中高。酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性;酶与底物的结合受溶剂的影响,底物专一性在有机溶剂中将发生改变；在水中酶和底物主要靠疏水作用,而在非水介质中疏水作用已不重要.主要决定于自由能的变化导致：对生产有利的改变，如底物特异性提高28，酶在有机介质中具有更高稳定性的原因?答：由于有机溶剂中缺少使酶失活的水分子,由水引起的酶分子中天冬酰胺脱氨基作用,天冬氨酸肽键水解,二硫键破坏,半胱氨酸氧化及脯氨酸和甘氨酸的异构化等蛋白质热失活过程全都难以进行29，酶在有机溶剂中表现催化作用与水的关系?答：与酶结合的水量是影响酶活力稳定性以及专一性的决定因素,

20、成功应用非水介质中的酶催化反应,控制酶结合水和水在酶分子中的位置是关键.水对于酶催化活性构象的获得是必须的,但水也与许多酶的失活过程有关.在非水酶体系中,含水量的微小差别会导致酶催化活性的较大改变.具体细化：（当酶周围的水化层受到破坏时,酶基本上是没有活力的,随着水化程度的增加,酶活力将得到恢复.酶需要水维持其活性三维结构,水影响蛋白质结构的完整性,活性位点的极性和稳定性;酶周围水的存在,能降低酶分子的极性氨基酸的相互作用,防止产生不正确的构象.含水量太高时,酶结构的柔性过大,酶的构象将向疏水环境热力学稳定状态变化,引起酶结构的改变和失活.）30，非水介质中酶的催化作用与溶剂的关系?答：有机溶

21、剂对酶的动态的影响有机溶剂通过改变蛋白分子的动态移动性及构象来影响酶的活力。溶剂对酶的结构的影响在有机溶剂中，酶的整体性和活性中心的结构都保持完整，但酶分子本身的动态结构姐表面发生不可忽视的变化。溶剂对酶活性中心的影响溶剂会减少整个活性中心的数量。酶活性和溶剂的属性存在定量学习必备欢迎下载关系溶剂的几何形状也影响非水介质中酶的活性31，酶在非水介质中主要酶学性质的变化答：酶的催化活性和稳定性酶分子结构动态变化，即蛋白质的刚性变强，活动自由度变小导致酶活力的变化。而在非水介质中有水引起的酶分子中天冬氨酰脱氨作用等蛋白质热时候的过程难以进行，以及蛋白酶在非水介质的缺乏致使其稳定性增强。酶催化的选择

22、性底物特异性，对映体的选择性，位置选择性，化学键选择性等发生改变微水有机溶剂中酶催化的动力学非水介质中酶催化的动力学中催化机制，米氏常数等不同于水相中酶动力学非水相酶催化的其他性质酶在有机溶剂中存在“分子记忆”效应32，最适水量,pH记忆与pH忘记最适水量:是保证酶的极性部位水合,表现活力必须的,也叫必需水.有机溶剂中的酶能够记忆它冷冻干燥或丙酮沉淀前所在缓冲液中的pH,这种现象被称为酶的pH记忆.微水有机溶剂中疏水性的酸或碱与它们的盐组成的混合物,可以作为有机相缓冲液,这两种形式的比例控制着有机相中酶的解离状态,使酶完全忘记干燥前它所处的水溶液的pH值,这种现象叫pH忘记第六章以概念：人工酶

23、：又称模拟酶模型，它是吸收酶中那些起主导作用的因素，利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程酶的人工模拟分子印迹分子印迹(molecularimprinting):制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程.这个分子叫印迹分子(printmolecule,P),也叫模板分子(template,T).分子印迹酶利用分子印迹技术制备能与底物特异性结合并具有一定的催化能力的聚合物叫分子印迹酶,是模拟酶的一种第七章：39，抗体酶：本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白40，理解抗体和抗体酶以及抗体酶和一般蛋白酶的不同？（例如前者底物结合方式，后者基态和过渡态的区别）酶和抗体的本质区别就在于：酶是能与底物的反应过渡态选择结合的催化性物质，而抗体是和底物的基态分子紧密结合的物质。抗体酶与蛋白酶的异同：同：同是蛋白质，选择性结合底物，催化效率高，专一性，可以进行化学修