药代动力学实验

1、药代动力学实验神农尝百草 传说神农一生下来就是个“水晶肚”，几乎是全透明的，五脏六腑全都能看得见，还能看得见吃进去的东西。那时候，人们经常因乱吃东西而生病，甚至丧命。神农为此决心尝遍百草，能吃的放在身体左边的袋子里，介绍给别人吃；不好吃的就放在身体右边袋子里，作药用。不能吃的就提醒人们注意。生物样品药物代谢动力学定量研究药物（包括外来化学物质）在生物体内吸收、分布、排泄和代谢（简称体内过程）规律的一门学科。常用测定方法 HPLC-UV ?GC-MS ? LC-MS/MS ?数据处理分析3原理与标准操作规程(SOP)2.实验设计与动物实验3.样品处理与方法开发4.定性定量与分析测定5.数据处理与

2、药动学参数计算6.实验报告实验安排静注加替沙星在家兔体内的药代动力学研究HPLC原理与标准操作规程(SOP)的组成2.分配色谱的原理3.色谱柱4.流动相5.定性与定量方法6.样品的预处理7.反相色谱分析方法的开发 High Performance Liquid Chromatography HPLC 的组成 Pump 泵 Injector/Autosampler 进样器/自动进样器 Column 色谱柱 Detector 检测器 Data System/Integrator 数据系统/积分仪表高效液相色谱系统高效液相色谱系统SHIMADZU LCMS-2010EVLC-MS/MS Thermo

3、 TSQ Quantum Access分配色谱的分离机理分配色谱概述反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱常用的流动相：有机溶剂如甲醇、乙腈，水应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法常用固定相：碳十八、碳八、胺基等基团反相色谱固定相多为键合相对HPLC柱的了解色谱柱分类填料，含碳量，基质，粒径色谱柱的应用正相柱，反相柱，预处理柱色谱柱的规格岛津 Shimadzu VP-ODS; 150L2.0; 5m; 柱号 8082693.键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。优点固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用

4、多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点pH值不能小于3同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同反相C18色谱柱的活化步骤一：90%甲醇1mL/min流速冲洗30min步骤二：10%甲醇1mL/min流速冲洗30min步骤三：90%甲醇1mL/min流速冲洗60min色谱柱的存放存放前的处理除去杂质、盐 合适的存放溶剂避免色谱柱床的干枯避免机械震动防止细菌生长注意存放的温度液相色谱对流动相的要求除色谱柱对流动相对的要求外，还有与检测器匹配脱气避免卤素离子（不锈钢系统）溶剂的粘度细菌的生长流动相的脱气流动相脱气的目的使色谱泵的输液准确输液均匀准确，并且脉动减小保留时间及色谱峰面积的重现性提高提高检测的性能防止气

5、泡引起的尖峰基线稳定，信噪比增加溶剂的紫外吸收本底降低保护色谱柱减少死体积防止填料的氧化流动相脱气的方法加热简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化抽真空同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果超声波简单，但效果不理想。通惰性气体（一般用氦气）可保持连续脱气，多用于低压梯度脱气机可保持连续脱气，多用于低压梯度色谱峰定性鉴别每个色谱峰通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份大多数情况下用比较保留时间来定性即所谓：保留时间相同，可能是同样的组份保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性用“标样”的保留值定出被测组份的位置标准加入法举例 废水样品

6、中五氯苯（PCP）的分析PCP4 ppm3 ppm2 ppm1 ppm常用的定量方法峰面积百分比法由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用外标法在液相色谱中用的最多内标法准确，但是麻烦在标准方法中用的最多外标法定量配制一系列已知浓度的标样外标法定量（二）实际色谱图标准曲线内标法定量（一）配制一系列浓度的标样，其中加有内标样内标法定量（二）实际色谱图标准曲线内标法定量（三）对内标物的要求化学结构与待测组分相似(同系物、异构体)在样品中不存在不与样品中组份发生任何化学反应保留值与待测组分接近浓度（响应值）与待测组分相当其色谱峰与其他色谱峰分离好可接收的检测范围校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有

7、效，高或低于这些点都可能引起计算错误样品的预处理样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护样品的预处理重要性占样品分析时间的比例样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品实验的重复性及准确性最差的环节影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤样品预处理常用的方法高速离心过滤、超滤选择性沉淀衍生反应液-固萃取 / 液-液萃取 Sep-Pak样品处理小柱其他选择性沉淀常用于生化样品中除蛋白有机溶剂乙腈，甲醇强酸三氯乙酸，过氯酸盐50% 硫酸铵10% TCA样品分析时第一步干什么?想办

8、法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献，如CA(化学文摘)仪器制造商的文献，如Waters对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法充分了解您自己的样品分析时要了解哪方面的情况？灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用? 使用文献方法色谱柱填料的种类、品牌是否相同?注意文献方法的流动相是否损害色谱柱?如色谱填料品牌不同，需要调整流动相注意色谱柱的规格：内径、柱长需要调整流速、进样量注意梯度条件了解系统的滞后体积（梯度）反相色谱的方法开发开发过程实例色谱条件色

9、谱柱：C18，4mm30mm流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱流速：2ml/min样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)改变流动相比例谱图改变流动相组成通过改变流动相改变选择性同样强度的不同溶剂改变色谱柱离子型化合物的分离方式使用离子交换柱离子交换法主要用于“强”阴、阳离子使用反相柱离子抑制色谱法通过改变流动相的pH值，使样品成中性离子对色谱法加入“对离子”，使样品呈中性离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑

10、制样品离子的电离适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的范围内硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内常用缓冲液及其pH值离子抑制色谱实例在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。其他精密仪器操作标准操作规程(SOP)要点高速冷冻离心机：配平、十字交叉、样品选择普通离心机：配平、十字交叉、样品选择万分之一电子天平：称量量程范围、记录、保养紫外可见光分光光度计：预热、样品量、校准涡旋振荡器：涡旋程度超声机：超声效果、时间药代动力学实验室的要求1.环境的要求：灰尘、湿度、阳光是分析仪器的大敌2.所写即所做3.分析测定用试剂为色谱纯及以上，水为超纯水4.痕量分析对实验人员有较高要求5.对仪器设备的操作严格按照SOP执行，专人管理和 维护保养6.良好的实验习惯HPLC-UV测定加替沙星的血药浓度如何着手？查文献：中国优秀期刊论文数据