鸡胚培养和细胞培养

1、第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人 类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一 （衣原体、立克次体 的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑 炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和 疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展， 不少病 毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养 手段。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条 件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。当然，鸡胚培养也有其缺

2、点， 即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外， 多需用第二试验系统来测定病毒存在 与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有 鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。因此，用鸡胚分离培养病毒时，必 须考虑这些问题。原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF鸡胚。一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发 育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼 嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获 高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病 毒，特别是已不利于收获病

3、毒材料。在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎 腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构 如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换， 卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在 内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。 如果湿度太低，鸡胚就 容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的 钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血 管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为

4、尿囊膜，系内胚 层形成，两膜所夹为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚 胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液， 以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在 11-13日龄时最高，平均达6毫升左右。羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎 浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液， 以后蛋白质含量增加。羊水量在 8-15日龄时最高，平均约为1毫升左右。附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由 内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。卵的尖端（俗称“小头”） 是卵

5、白，是胚胎发育晚期的养料。干条腔二、鸡胚培养实验用器械不鸡胚培养技术简便，但一些最基本的设备仍需具备，它们包括：孵化箱、 检卵器、卵架、打孔器、银子、酒精灯、无菌眼科银子和剪刀、吸头、洗耳球、 注射器、适用的针头、无菌试营、平皿、三角瓶、烧杯、消毒胶布、石蜡和灭菌 生理盐水等。下面就一些最基本的设备作一简单介绍：孵化箱是给受精卵提供发育条件的设备，要求恒温恒湿。市售专用孵化箱可 自动进行气体交换和翻蛋。实验室中，常用普通恒温培养箱或恒温室代替， 要注 意保持室内湿度和人工翻蛋。检卵器 有市售专用检卵器，在暗室中操作。也可根据条件向行设计，用木板 制成一大小为35 X 25.5 X 15厘米的木

6、盒，上半层为一暗室，上方开一小孔， 以便于用眼检视鸡胚，两侧开大孔以供双手伸入小暗室转动鸡胚蛋和进行标记。 木盒中间有一隔板，其中间部位开一卵形圆孔，木盒下层安装有100瓦灯泡，待检胚蛋置于卵形孔上。开灯检查，不必在暗室中进行。打孔器可用剪刀代替.卵架孵育用盛放鸡胚蛋的卵盘有市售专用者，实验操作中所用卵架可用木 板制成小方盒，上面开一卵形孔。三、鸡胚的实验室孵育选择实验室用鸡卵，最好用白色薄壳鸡蛋，具易于观察胚胎的生活情况。实 验用卵一般不宜保存过长时间，通常保存期不应超过10天,5天以内最好。而且不宜在高温下保存，通常保存于 420 c，以10 C条件下最好。适宜的 孵育温度为3839 C

7、,相对湿度为4560 %,并注意空气流通。孵育3天后 每天应翻卵12次，以保证气体交换均匀，发育齐全，从而避免半边发育现象 的出现。孵后第四天用检卵器对鸡卵进行检视，检出未受精卵和死亡的鸡胚。经 四天孵育后，未受精卵不见有鸡胚迹象，仅见模糊的卵黄暗影；受精卵则可见清 晰的血管小团，其中有鸡胚迹象，较大的鸡胚可见到胚胎主动运动；濒死或死亡的鸡胚则见到胚胎运动呆滞或不运动， 血管昏暗、折断或漂落，这种鸡胚应剔 出不用。四、鸡胚的接种.绒毛尿囊膜接种主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖，这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上 形成痘斑和病斑。此外其它用于绒毛尿囊腔接种的病毒也可使用，而且收毒量更 高，缺点是操

8、作不易成功。选取10-13日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出，并在胚位附近无大 血管处，划一记号，用蛋钻在卵壳上磨一裂缝（或用电烙器在卵壳上烙出一个直 径为2-3mm的烤焦圈），小心将蛋壳去掉，注意切勿损伤壳膜；在气室中央也钻 一个小口，用针尖挑破壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加1滴无菌生理盐 水于刺破处，用吸耳球紧贴气室中央小口，造成负压，即可见生理盐水下沉，绒 毛尿囊膜凹下，和壳膜分开，造成人工气室。滴加 0.05-0.1ml接种物于绒毛尿 囊膜上，腊封口，封口部位朝上，不要翻动，37c培养。.尿囊腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如禽流感病毒和新城疫病毒的分离和增 殖，马脑炎病

9、毒也常用、 旧D、旧DV也可。选取9 -11日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出，在气室边缘上打一 小口，避开大血管处，注射器沿小口插入1-1.5cm,注入接种物0.1-0.2ml ,腊封口。.卵黄囊接种主要用于虫媒批膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体的分离和增殖。选取6- 8日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出；垂直放置在卵座上，在 气室中央钻一个小口，注射器沿小口插入 3 cm,注入接种物0. 1-0.5ml ，腊封 口。.羊膜腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖，操作技术比较困难。A.开窗法：从气室处去蛋壳开窗，从窗口用小银子剥开蛋膜，一手用平头镶 子夹住羊腹腔向上提，另一手

10、注射 0.05-0.1ml接种物于腔内，使蛋直立孵化， 此法可靠，但胚胎易受伤而死，而且易污染。B.盲刺法：将鸡胚放在灯光向上照射的蛋座上，使蛋转动使胚胎面向术者。 在气室顶部到边缘的一半处打一孔，用40mmfc的针头垂直插入，月深30mmz上。 如已刺如羊膜腔，能使针头拨动胚即可注入接种物 0.1-0.2ml ,如针头左右移动 时胚胎随着移动，则针头已刺入胚胎，这时应将针头稍提起后再注射，石蜡封口。五.鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。(1)绒毛尿囊膜：用碘酊、酒精消毒接种部位及四周，揭去封闭处的卵壳。用灭菌银子扩大开口处，轻轻夹起绒毛尿囊膜，用消毒剪刀剪下接种面及周围的膜，

11、置于灭菌生理盐水的平皿中。(2)尿囊腔接种：收获前将鸡胚置 4c冰箱中6h或过夜将鸡胚冻死而使血液凝 周，以免收获时流血。用碘酊、酒精消毒气室部位卵壳，以无菌银子击破气室端 卵壳，沿气室周围剪去卵壳，撕去壳膜和绒毛尿囊膜，用银子轻轻压住胚胎，以 无菌吸管或注射器吸取尿囊液于灭菌试管内。 收集的液体应清亮，浑浊则表明有细菌 污染；呈血红色，说明血管破裂；黄色液体，可能卵黄囊被刺破。应做无菌检验。(3)羊膜腔：首先收取尿囊液，方法同上。后用注射器插入羊膜腔内收集，约 可收到1ml液体，无菌检测。(4)卵黄囊：先首先收取尿囊液和羊腹腔液，后用吸管吸卵黄液。将整个内容 物倾入无菌平皿中，剪取卵黄膜保存

12、。第二节细胞培养常用设备准备室的设备：单蒸储水蒸储器、双蒸储水蒸储器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配 置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80 C）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设 备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO0俘箱（孵育培养物）、 水浴锅、三氧消毒杀菌机、4c冰箱（放置serum和培养用液）。无菌操作无菌室的灭菌：.定期打扫无菌室

13、：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等， 然后用3%来苏尔或者新洁尔灭或者0.5 %过氧乙酸擦拭。.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3%新洁尔灭擦拭，然后用75%酒精擦拭或者0.5 %过氧乙酸，再用紫外灯照射.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟.实验后灭菌：用75%酒精（3%新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的 载物台。实验人员的无菌准备：.肥皂洗手。可减少手上的微生物。.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋。但是在洁净工作台上时就无需上 述防护。如果你有长头发，则应把它系在脑后。不要说话或少说话。如果感冒， 则最好不要做组织培养工作。.用75

14、%酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示：.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75%酒 精擦拭瓶子的外表面.靠近酒精灯火焰操作。.器皿使用前必须过火灭菌.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒一、新的玻璃器皿的洗消：.自来水刷洗，除去灰尘。.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5%稀盐酸中12小时以除去脏物、 铅、种等物。.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净 后用烤箱烘干。.

15、泡酸、清洗：用清洁液（重铭酸钾 120g：浓硫酸200ml:蒸储水1000ml）浸 泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15次，最后蒸储水冲洗3-5 次和用双蒸水过3次。.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气 成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向 15磅时，维持20-30分钟。.高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消：.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过 来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内

16、捞出器皿立即用 自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸储水冲洗3次。.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消 毒储存及防止灰尘和再次被污染。.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压 表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃 培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。 金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后 用75

17、%酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸储水冲洗，再烘干或空气中晾干。放 入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。 橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸储水冲 干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：.针式滤器帽不能泡酸液，用NaO的6-12小时，或者煮沸20分钟，在包装之前 要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上（凹向上），然后将螺旋稍微拧松一些， 放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使 用时应该立即将螺旋旋紧。.胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30

18、分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30分钟，再用自来水，蒸储水， 三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。.胶帽，离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间 不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30分钟，再用自来水，蒸储 水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。.胶头可用75%酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。.塑料培养瓶，培养板，冻存管：.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70%酒精 浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。 也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒

19、后需要用2-3周时间洗除残留的氧化乙烯。 用20000- 100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆， 可在纸包装后，用密写墨水作好标 记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水， 在包装纸上作一记号，平时这种墨水 不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配 制：氯化钻（CoC126H2o）2g, 30%盐酸10ml,蒸储水88m1 注意事项：.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸储水，以防高 压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻， 会降低高压消毒效果。检查安 全阀是否通畅，以防高压时爆炸。.安装滤膜时

20、注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过 滤的作用。.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤 害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面， 会腐蚀地面。C.器皿浸入酸 液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、 磁力搅拌器。具体步骤：. 水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、 三蒸水或纯净水.PBS的制备与消毒（也可用于其它BSS如：Hanks, D-Hanks液的配制）：.溶解定容：将药品（

21、NaCl 8.0g, KCl 0.2g , Na2HPO4 H2O 1.56g, KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量 瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS容液。.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插 上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸储水补充蒸 发掉的水份。.胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或 者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用 时间有关，在pH为8.0、温度为37c时，胰

22、酶溶液的作用能力最强。使用胰酶 时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2卡Mg2+ 的BSS如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终 止胰酶对细胞的作用。.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。 搅拌混匀，置于4c内过夜。.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20 C保存以备使用

23、。.青、链霉素溶液的配制于消毒.所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双 蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克？ 五.RPMI1640的制备与消毒：.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3的双蒸水中，并用 双蒸水冲洗包装袋2-3次（冲洗液一并加入培养基中），充分搅拌至粉剂全部溶解， 并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉 素液各0.5ml,使青链霉

24、素的浓度最终各为 100单位/ml。然后用一个当量的盐 酸和NaOHS PH到7.2左右。最后定容至1000ml,摇匀。.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和 支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4c冰箱内待用。.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4c时两周有效）。六.血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56c水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。.HEPES容液：HEPES勺化学全称位

25、羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N -a-hydroxythylpiperazine-N - ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长 时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L, 一般培养液内含20mmol/LHEPES|3可达至IJ缓冲能力。1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4c保 存。注意：因为现在市售HEPESfel勺10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制， 但是要保证培养液内HEPES勺终浓度仍然为20mmol/L。如：称取4.766克HEP

26、ES 溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml 培养液中加入2ml即可。.谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺， 其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合 成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4 c下放置1周可分解50%,故应单独配制，置于-20 C冰箱中保存，用前加入培养液。 加有谷氨酰胺的培养液在4c冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰 胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液 贮存，用时加入培

27、养液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g溶于三蒸水加至100ml 即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20 C保存， 使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。.肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml 0因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 0.56克/瓶，配制时，可将 其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 -C。使用时，向100ml培养液中加入1ml （精确可加入0.9ml）即可。十.I型胶原酶：0.1 % I型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注

28、意：因为I型胶原酶 分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶-20 C保存。十一.明胶溶液：因为明胶难于过滤，所以配制0.1 %明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备 过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量 0.1克（配成100ml 溶液）一即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中，4c保存。其他培养用液的配制：20ug/ml内皮生长因子，注意事项：.配制溶液时必须用新鲜的蒸储水。.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置

29、 为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。.配制RPMI164g养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了 保证培养液PH值最终为7.2 ,可在配制时调PH至7.4。细胞传代培养（消化法）具体操作：一.传代前准备：.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37 c水浴锅内预热。.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。.取出预热好的培养用液：取出已经

30、预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方 能放入超净台内。.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显 微镜的台面，再在镜下观察细胞。.打开瓶口：将各瓶口打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。.胰蛋白酶消化；.加入消化液：小心吸出旧培养液，用 PBS青洗（冲洗），加入适量消化液 （胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37Co.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之 间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的 培养减。.吹打分散细胞：.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液

31、。.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10ml离心管中。.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入 2ml培养液，用滴管轻 轻吹打细胞制成细胞悬液。.分装稀释细胞：.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧 瓶盖。.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密 度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于 5X 105/ml 0最后要 做好标记。.继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO加养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面

32、积占培养瓶底面积 25% 时为一个十,占50%为+ + ,占75%时为+ + +。传代细胞培养注意事项：.严格的无菌操作.适度消化：消化的时间受消化液的种类、 配制时间、加入培养瓶中的量 等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩， 连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。附：EDTA（0.02 %乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：EDTA0.20g , NaCl 8.00g , KCl 0.20g , KH2PO40.02g , 葡萄糖 2.00g , 0.5 % 酚红4ml,加入蒸储水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节 PH 到7.4。注

33、意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时 细胞容易脱壁.细胞的复苏细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196 C液氮中的细胞快速融化至37 C,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。具体操作 一.实验前准备：.将水浴锅预热至37 C.用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。.取出冻存管：.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。.迅速解冻：.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并

34、要不断的摇动， 使管中的液体迅速融化。.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外 壁，再拿入超净台内。.平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中 3000r/min离心3min.制备细胞悬液：.吸弃上清液。.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。.细胞计数：细胞浓度以5X105/ml为宜。.培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37 C和5%CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的 时间由细胞情况而定。初学者易犯错误：1水浴锅未预热或者未预热到37 C。.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间

35、延长。.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时， 通过测定一定体积悬液中的细胞 的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作：一.准备工作：取一瓶传代的细胞，按照传代细胞培养（消化法）中的传代方法繁 殖细胞，待长成单层后以被使用。.细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用0.25 %的胰蛋白酶液消化、PBS1洗涤后，加入培养液 （或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。.细胞计数：1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。.制备计数

36、用的细胞悬液：用吸管吸 5滴细胞悬液到一离心管中，加入 5 滴台盼蓝染液（0.4%）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显 微镜下区别活细胞和死细胞。.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿 盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让 悬液流入旁边槽中。.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并 移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铭（每个大格含有 16个中铭）中没有被染液染上色的细胞数目。.计算原细胞悬液的细胞数：按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml =（四个大格子细胞数/4

37、） X2X104说明：公式中除以4因为计数了 4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1: 1稀释。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：四.细胞计数要点：.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml ,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每 次取样都要混匀，以求计数准确；.数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞 计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。.操作时，注意盖片下不能有气泡，

38、也不能让悬液流入旁边槽中，否则要 重新计数。.初学者易犯的错误：.计数前未将待测悬液吹打均匀。.滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。.滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。.本实验特殊试剂的配制：4%台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸储水研磨，加双蒸水至100毫升, 用滤纸过滤，4c保存。使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4 %即可。细胞的冻存.先将冻存管放入4 c冰箱，约40min。.接着置于-20 C冰箱，约30-60min。.置于-80超低温冰箱中放置过夜。.置于液氮罐中长期保存。5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。注意事项：.使用DMSOf,不需要进

39、行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而 会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMS财人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。.不宜将冻存细胞放置在 0c-60 C这一温度范围内过久，低温损伤主要发生 在这一温度区内，是“危险温区”。.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。鸡胚原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞的制作）取9-11日龄的鸡胚，将胚蛋气管端向上，用碘酊、酒精消毒气室，以银子击碎 卵壳并弃之，沿气室周围剪去卵壳，撕去壳膜和绒毛尿囊膜，取出胚胎于灭菌平 皿中。剪去头部、翅爪及内脏，以Hanks液冲洗体表数次，移入灭菌小瓶中，在 用剪刀剪成小块，使其成为约1mm狄小的碎块

40、，以Hanks液冲洗体表数次；自 水浴中取出预热的0.25%夷酶适量，一个鸡胚约需5ml胰酶，37C水浴消化15-20 分钟，其间每5分钟轻摇一次，至液体变得混而稍稠，此时再轻摇可见组织块悬 浮在液体内而不易下降时则终止消化，吸弃胰酶，再以Hanks液冲洗三次，经大 口吸管吹打分散，以少许营养液（DMEM?养液、10%卖牛血清、青链霉素500U/ml, PH7.2-7.4 ）轻轻悬浮，经8层纱布过率，收集的细胞经计数调整细胞浓度至 106 个/ml ,混匀，分装于细胞培养瓶中，于 CO邪养多!中37c培养24h-48h。长成 单层的细胞换液，加入维持液：DMEM?养液、5%卖牛血清、青链霉素5

41、00U/ml, PH7.2第三章电子显微镜技术观察病毒（2学时）教学目的：熟悉掌握病毒的电子显微镜观察技术。教学重点：样品的基本制备技术。教学难点：病毒电镜样品的制备。基本教学内容：第一节电子显微镜技术概述一.电子显微镜的发展光学显微镜发明后，即成为医学、生物学和其他学科不可缺少的研究工具。 可以 看到许多微生物和构成生物的基本单元一细胞。但随着人类认识的逐步深化，对 观察微小物体的要求越来越高。大型电子显微镜20100万倍0.1440.34nm中型电子显微镜520万倍0.341.0nm小型电子显微镜5万倍以下1.0nm以上 二.电子显微镜的分类1.透射电子显微镜2扫描电子显微镜其主要特点是景

42、深大，图像富有立体感，制样简便，在观察形貌的同时，还可以 利用样品发出的其他信息在微小区域上作成份分析和晶体结构分析。第二节电镜样品的基本制备技术一.超薄切片超薄切片法是研究病毒特征以及病毒与细胞之间相互作用的有效手段。a.将组织或细胞样品，加入2.5% PH7.2戊二醛进行前固定，4c 24小时；b.用PH7.2PBS?中洗三次,每次10分钟；c.用2刚氧化饿在通风橱内进行后固定1.5-2小时；d.用PH7.2PBS?中洗三次,每次10分钟；e.分别用浓度为50% 70% 80% 90% 100%勺乙醇进行月中K,每次10-15分钟, 100%L醇中脱水三次，其它浓度中各一次；f.用1: 1

43、的100%醇和丙酮、纯丙酮各置换一次，每次 10分钟；g.用纯丙酮和环氧树脂包埋剂按浓度梯度对样品进行浸透；h.将样品置于恒温培养箱中聚合；i.用ULTRACDTE超薄切片机进行切片，将切片用载网捞起，放入培养皿中；j.用醛酸双氧铝、柠檬酸铅分别对样品染色15-20分钟，双蒸水冲洗干燥后放入 培养皿中待检。二.负染色负染色也叫阴性反差染色。这种染色法是用重金属盐类溶液与样品混合而使样品 呈现出良好的反差。经这种方法染色的生物样品，在电镜下是暗背景下的亮物体 像，与通常的染色性质相反，所以称之为负染色。负染色的主要特点是反差强，分辨力高，可以看到病毒的亚单位结构；在较段时 间内可得出结果。负染色

44、使用的染液有磷鸨酸、磷铝酸、醋酸铀等。最常用的是：PH6.8的2%磷鸨酸溶液适用于多种病毒。被观察的材料最好是比较纯净的病毒悬液。三.扫描电镜样品的制备扫描电镜具有分辨率高和景深长等特点，因此图像层次丰富，立体感强，能够显示 细胞和组织的三维结构形貌，广泛应用于生物样品表面及其断面微结构的观察. 四.免疫电镜免疫电镜技术是把免疫化学技术与电镜技术有机地结合起来 ，使之兼有两方面的 特性，所以是研究抗原-抗体相互作用的一种方法.抗原-抗体之间的相互作用是 免疫化学反应的基础，它具有高度的特异性，结合电镜的高分辨能力和放大本领， 可在超微结构和分子水平研究各种组织和细胞内的免疫反应，并能精确定性、

45、定位和半定量，使形态与机能紧密结合。第四章 病毒和病毒成分的提纯(2学时)教学目的：熟悉掌握病毒和病毒成分的提纯。教学重点：病毒提纯的具体操作方法。教学难点：超速离心法提纯病毒的原理和方法。基本教学内容： 第一节病毒的提纯病毒的提纯，就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提, 去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓度的病毒样品。病毒的纯度只是一个相对的概念，通常以下列几点作为判定依据。(1)物理均一性(2)病毒滴度与蛋白质含量的比例(3)免疫学反应(4)结晶形成一.沉淀法.中性盐沉淀法病毒一般在45%Z上饱和度的硫酸钱溶液中沉淀，保持其感染性。.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇(P

46、EG为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为20006000的PEG将PEGS已置成50流右的溶液，或直接将固体PEGta于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在 4c搅拌过夜，然后 离心使病毒沉淀。3有机溶剂沉淀法4等电点沉淀法二.层析法.葡聚糖柱层析法.凝胶层析法.离子交换纤维素柱层析法.亲和层析法.红细胞吸附法所谓病毒的红细胞凝集反应，就是指病毒被红细胞表面粘蛋白吸附的现象。.电泳法.超速离心法病毒经初步浓缩之后，要进一步纯化，通常采用超速离心法.差速离心法差速离心法适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放的病毒悬 液中提纯病毒。以差速离心法分

47、离提纯病毒时，经常以低速（20003000rpm 20-30分钟） 及中速（10000rpm, 20-30分钟）去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其他 较大的杂质。然后，选择在60分钟内能够沉淀80犯上的病毒粒子的较高速度， 离心1-2小时，使病毒沉淀。对中、大型病毒如流行性感冒病毒，在经红细胞吸 附一稀释后，于25000rpm,离心60分钟，即可达到目的。小型病毒如脊髓灰质 炎、披膜病毒，则需以 35000-45000rpm离心1-2小时。.速度区带离心法是根据被分离物质在强大离心力中沉降速度不同而进行的分离方法。介质可以为均一密度，也可以梯度密度。当被分离的物质沉降到与介质密度相等的区域

48、是就 不再沉降。不同分子形成不同的区带，称为速度区带。常用的介质为蔗糖、甘油、 聚蔗糖。常用的梯度范围从 5%-20% 10%-60%.平衡密度梯度离心法大多数病毒的浮密度在1.10-1.40范围内；所制备密度范围为1.0-1.7的悬浮介 质，便可满足大多数病毒密度梯度离心的需要。六.超滤法利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩的一种方法。第二节 病毒蛋白亚单位的分离第三节病毒核酸的抽提第五章病毒的常规实验室诊断（4学时）教学目的：熟悉掌握病毒的常规实验室诊断方法。教学重点：病毒的血清学诊断。教学难点：病毒感染力的滴定和中和实验。基本教学内容：第一

49、节病毒的初步鉴定.病毒增殖的判定病毒在实验动物体、鸡胚和组织培养细胞内增殖，显然都会影响机体和细胞和生命活动，并经常通过一定的形态学和病理学变化表现出来。a.细胞病变（CPE细胞病变是病毒在细胞内增殖内增殖及其对细胞产生损害的最明显的表现，包括胞浆的颗粒变性、胞核的变形和破裂。细胞病变经常具有病毒“种”的特性，可以作为病毒鉴定的依据之一。b.细胞代谢的测定PH值下降c.抗原的测定d.病毒间的干扰现象.病毒感染力的滴定实验动物测定LD50（半数致死量）鸡胚上的EID50 （半数鸡胚感染量）组织细胞上测定TCID50 （半数细胞培养物感染量）I.Reed-Muench 法病母淞 稀释度细胞管观察结

50、果累计细胞管树三细胞管总数出现CPEffi胞 管所占的出现CPE管不出现CP 管三出现CPE管不出现CP 管10-1802710127F 100 (27/27)10-28019019100 (19/19)10-3711111291.6 (11/12)10-435461040 (4/10)10-517113140.7 (1/14)10-608021210(0/21)出现细胞病变（CPE以及血凝素等的细胞管数分别列于表 14-2的第2和第 3歹I，它们的累计数分别列于第 4和第5列（根据箭头所示方向），第6列为细 胞管总数，第7列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。可见该病毒株的TCID

51、。在10-3 （91.6%）和10-4 （40%之间，其确切稀释倍数可按下列公 式计算：91.6 （高于50%勺百分数）一5041.6 91.6 （高于50%勺百分数）一40 （低于50%勺百分数）5160.8将由上式获得的0.8加在高于50%E亡的稀释度的对数（3）上，因此该病 毒的TCID5。应是0.1ml 10-3.8稀释的病毒液。查反对数，得 6310,即该病毒6310 倍稀释液0.1ml等于1个TCID50O3.病毒理化特性的测定a.病毒核酸型鉴定是DNAW毒，还是 RNAW毒？b.脂溶性敏感性试验（1）乙醴敏感性试验（2）氯仿敏感性试验c.耐酸性试验d.胰蛋白酶敏感试验e.耐热性试

52、验f.病毒粒子大小测定第二节病毒的免疫-血清学检测1.中和试验中和抗体：动物在受到病毒感染后，体内产生抗体，如果该抗体能与相应的病毒 粒子特意性地结合，使后者丧失感染力，这种抗体称为中和抗体。中和抗体一般是针对病毒的蛋白衣壳或囊膜抗原的，并不是针对病毒粒子的内部成分。应用已知的病毒或病毒抗原，可以测知患病动物体内中和抗体的存在及其 效价。应用已知的抗病毒血清或中和性单克隆抗体，也可以进行病毒的鉴定，因此中和试验也常用于新分离病毒株的鉴定。中和试验具有高度的敏感性和免疫特意性， 常可用以侦察其他血清学反应难以测出的病毒株之间的抗原差异。进行中和试验，首先要选择试验宿主。（1）终点法中和试验有固定

53、病毒一稀释血清法和固定血清一稀释病毒法a.固定病毒一稀释血清法：将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般 100个TCID5。EID50、LD5。混合，置适当的条件下感作一定时间以后，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细 胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。以能保护50%&织培养细胞、 鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的 50刈和效价。病毒稀释-血清-感作一对照一接种一观察和解释一b.蚀斑减数试验蚀斑：用稀释的病毒液感染单层细胞，由于其致细胞病变作用，而在单层细胞上 形成蚀斑。从理论上讲，一个病毒粒子形成一个

54、蚀斑，因此根据蚀斑的大小、形 状和色泽等性状，选择不同的代表进行移植传代，就有可能获得若干不同的纯系 毒株。但在实际上，一个蚀斑往往由几十个乃至几百个病毒粒子形成。因此，由 一个蚀斑分离获得的毒株常是许多个病毒的后代，需要进行反复多次的蚀斑分 离，才有可能获得来源一个病毒粒子的“纯系”病毒。病毒+正常动物血清蚀斑数（平均）待检血清稀释+病毒 中和后蚀斑数（平均） 能使病毒蚀斑减少50%勺血清稀释度。c.交叉保护试验2,血凝和血凝抑制实验病毒+红细胞一凝集血凝的条件和特点：1822c最适宜操作方法：1,取血凝板，做好标记.2,按表1顺序和剂量加入各种材料表1.红细胞凝集试验的操作程序单位：ul病

55、毒稀 1:21 1:22 1:2 3 1:24 1:2 5 1:26 1:2 7 1:2 8 1:2 9 1:210 1:211 对释度照生理盐水25252252525252525252525弃25 251%红细胞252525252525252525252525.摇匀，放室温30min,观察结果。.结果判定操作方法：1,取血凝板作好标记2,按表4的顺序和剂量加入各种材料:表 4: 红细胞凝集抑制试验的操作顺序单位：ul血清稀释度 1:21 1:22 1:23 1:24 1:25 1:26 1:27 1:2 8 1:2 9 血清病毒血球对照对照对照生理盐水抗血清病毒液25252525252525

56、2525弃25252525252525252525252550251%1细胞252525252525252525252525.摇匀，置室温45min,观察结果。.结果判断.琼脂扩散实验应用病毒琼扩标准阳性血清通过琼脂免疫扩散试验对本试验所分离到的病毒进行鉴定，具体操作过程如下：用 0.85%NaCL溶液配制含1%脂糖的凝胶溶液， 加热待琼脂糖完全溶解后注入平皿中，凝固后置于4c冰箱2h后，取出打孔，剔除孔内的琼脂，用酒精灯加热封底，中央孔为病毒琼扩标准阳性血清， 周围留 一孔为阳性对照，其余孔为经初步提纯的病毒悬液。.免疫荧光实验将-70 C保存的一份感染脏器冰冻切片成 4pm置于载玻片上，用

57、丙酮固定，室 温5分钟，用0.01M pH7.2的PBSa涤3次，每次5分钟，晾干后加入相应的阳 性血清（1:16稀释）37c作用45分钟。用PBS?中洗3次，每次5分钟，晾干后 加入含0.01%伊文思蓝的荧光标记的兔抗鸡IgG （, 37c作用45分钟，PBS冲 洗3次，每次5分钟。晾干后用缓冲甘油封片，用OLPMPU光显微镜观察和拍 照。同时设立阳性对照、阴性对照、荧光抗体对照第六章病毒的分子生物学诊断（4学时）教学目的：熟悉掌握病毒的分子生物学诊断方法。教学重点：病毒核酸的提取和 PCR技术。教学难点：PCRfc术。基本教学内容：概述近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，尤其是分子遗传学

58、的进步，大大 提高了病毒病的诊断水平o病毒病的实验室诊断技术已从常规的病毒分离鉴定以 及抗原和抗体的免疫学检测，进入可对病毒基因序列和结构直接进行测定的分子 生物学水平。病毒病的分子生物学诊断，包括对病毒核酸（DNAl RNA和蛋白等的测定，关键在于测定这些分子的特异性序列或结构。病毒基因往往含有特异 序列，可以用核酸杂交的方法予以检出，而这段序列的存在则说明了相应病毒的 存在。虽然病毒是严格细胞内寄生的最小、 最简单的生命形式，但也具有与宿主细 胞不同的独特的核酸序列和基因结构。常用的分子生物学诊断技术包括基因组电 泳分析、DNAR切图谱分析、寡核甘酸指纹图、核酸杂交、聚合酶链式反应（PCR

59、 等。其中核酸杂交和PC叱术又以其特异、快速、敏感、适于早期和大量样品的 检测等优点，成为当今病毒病诊断中最具有应用价值的方法。DN麻交的灵敏度已经提高到0.05pg/ul ,也就是说，只要有1000个DN砌贝，就可能被检测出 来。使用PCRS至可以检测出一个拷贝的 DN6子。第一节病毒核酸的提取技术悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解a）于4c以2000g离心5分钟收集细胞，以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷 酸缓冲液悬沉淀，洗涤细胞3次，每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀，使其彻底分散。b）估计细胞沉淀的体积，用10-20倍体积的RNNS取缓冲液重悬之。c）加入与步骤b）所加RNA提取缓

60、冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液，用振荡器 迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯 管内。重复3 4次，剪切DNAd）加蛋白酶K至终浓度为200仙g/ml,充分混匀后置于37c温育30分钟。蛋白 酶K以贮存的形式保存，贮存液为20g/ml蛋白酶K水溶液。二提取步骤1）用等体积酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白质。2）用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相，将水相吸至一个新的离心管内，加2.5倍体积用冰预次序的乙醇，充分混匀，于 0 c放置1小时。3）于0c以5000g离心10分钟沉淀RNA弃上清，用含 0.1mol/L乙酸钠（pH5.2）的70%乙酸