半夏蛋白的分离纯化及其对Hela细胞的生长抑制

1、 .en PAGE - 6 -半夏蛋白的分离纯化及其对Hela细胞的生长抑制周旭鹏，杨炜鑫，童富淡，徐涛浙江理工大学生命科学学院 杭州310018E-mail：fdtong摘要：半夏是一种传统的常用中药。近年来的研究发现半夏蛋白在半夏众多的化学成分中具有明显的生物活性，是半夏抗肿瘤和抗生育等药理作用的主要有效成分。本课题用Tris-HCl缓冲液对半夏总蛋白进行提取，再以硫酸铵的不同饱和度对其进行初分离，接着以凝胶层析对初分离得到的蛋白进行纯化。最后用MTT法对分离得到的蛋白进行海拉细胞生长抑制试验，检测其体外抗海拉细胞效果。关键字：半夏蛋白；凝胶层析；电泳；MTT中图分类号：Q8161.引言半

2、夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata( Thunb.) Breit 的块茎, 是一种重要的中药材。主产于甘肃、河南、四川、湖北、辽宁、陕西、山西、安徽、江苏、浙江等地。半夏主要含有淀粉( 占75%左右) 、生物碱、半夏蛋白、- 谷甾醇、多糖、氨基酸、挥发油及无机元素等多种化学成分1-5。其药理作用有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结；外用可治急性乳腺炎、急慢性化脓中耳炎等，是传统的常用中药之一；近年来研究发现，半夏还具有抗肿瘤、抗生育、降血脂和治疗冠心病等重要药理作用6-7。半夏蛋白具有抗肿瘤药理活性8。癌症已成为了严重危害人类生命健康、且难以治愈的疾病之一。为治疗和预防各类癌症，世

3、界各地的科学家和医务工作者对其进行深入研究，特别是在有效治疗药物的研制开发方面做了大量的工作。现在，许多科学工作者将目光投向了中国瑰宝-传统中药。中药是中国几千年传统医药文化的结晶。随着研究的深入，人们对中国传统的中药、中医对于一些恶性肿瘤的治疗效果和潜在的医疗价值尤为关注：一方面是由于中国的药物资源异常丰富，90年代全国中药资源普查资料表明，我国目前的中药资源种类达12 807种，这为抗肿瘤药物的筛选提供了巨大的资源宝库；二是因为中医对中药的独特使用方法。本项研究通过Tris-HCl缓冲液进行提取、再对提取液进行硫酸铵分级盐析的方法，从半夏块茎中提取半夏总蛋白并初步分离半夏蛋白。借助凝胶层析

4、对得到的蛋白进行进一步的分离纯化，得到纯化的蛋白。利用在体外培养的癌细胞对在不同盐饱和度所析出的半夏蛋白进行体外抗肿瘤活性的研究，利用MTT法检测其对癌细胞的抑制生长效果。本课题得到浙江省大学生科技创新活动计划（浙教高教200930号）资助。2.材料与方法2.1 材料三叶半夏块茎采自山东菏泽。2.2 方法2.2.1 半夏蛋白的提取先将半夏块茎用水浸泡一天，去皮、洗净，称取50g。接着将称取的半夏块茎置于研钵中，加入少量石英砂，研磨充分；在研磨过程中不断加入总体积为200ml的0.05 M Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液。再将研磨好的溶液置于离心管（50ml）中，离心(10000rpm,

5、30min，40C)。分离两相，收集上清液，置于大离心管中备用。2.2.2 半夏蛋白的初分离用量筒量取上清夜体积，再将上清液置于烧杯中，缓慢加入硫酸铵，调饱和度至 30%；放在40C冰箱中，盐析过夜。将盐析的样品离心（10000rpm，30min，40C），分离两相，分别收集上清液和沉淀。重复以上操作，将硫酸铵饱和度调至45%，60%和75%进行盐析过夜，分离得到蛋白沉淀。半夏蛋白的纯化用Sephadex（G-100）进行蛋白纯化。用PBS缓冲液将蛋白沉淀溶解，上样，以0.4ml/min的流速进行凝胶层析，根据核酸蛋白检测仪，用试管收集样品。蛋白浓度测定分别对初分离和纯化得到的蛋白样品进行浓度

6、测定。将经过预处理的透析袋用PBS清洗干净，用透析袋夹夹住一端，将蛋白样品和装入透析袋中，夹住另一端。将透析袋放入盛有PBS的烧杯中进行透析，每3小时换一次PBS，直至无硫酸铵为止。透析好的蛋白样品进行离心（10000rpm，30min，40C），收集上清液。以酪蛋白为标准蛋白，用紫外可见分光光度法对半夏蛋白进行浓度检测。SDS凝胶电泳 对初分离和纯化得到的蛋白样品进行SDS凝胶电泳，分析蛋白样品分离纯化效果。MTT法检测分别将以饱和度为45%（组分一）和60%（组分二）进行盐析并且经过纯化的样品配制成终浓度为0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.025mg/ml的蛋白溶液。将对数生长期H

7、ela细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，再用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配成浓度约为1106个/L的单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100l。接着将培养板放置于CO2培养箱中，在37，5% CO2条件下，培养，24h后补加100l RPMI1640培养基（含10%小牛血清）。取蛋白样品各20l分别加入96孔培养板的各孔中。对照组加20 ul PBS溶液。继续培养至24小时。每孔加入5mg/ml MTT溶液20l，37温育4h，小心吸去孔板中的培养液后每孔加入200l DMSO，在恒温振荡器上震荡5min。在上述条件下，用自动酶标仪在波长490nm处测定每个孔的吸光值（OD值）。

8、抑制率（%）=(对照组 - 实验组)/对照组*100% 。3. 结果3.1 紫外可见分光光度测定3.1.1 初分离得到的蛋白浓度测定图1.蛋白浓度标准曲线表1.初分离蛋白浓度统计表 硫酸铵饱和度30%45%60%75%A2800.2620.430.320.175蛋白浓度(mg/ml)0.658 1.079 0.803 0.439 初分离蛋白含量（mg）5.06641.00212.8484.393.1.2 纯化后蛋白浓度测定图2. 蛋白浓度标准曲线表2.纯化后蛋白浓度统计表硫酸铵饱和度45%第一组分45%第二组分60%第一组分60%第二组分A2800.2390.3690.0510.151纯化蛋白

9、浓度(mg/ml)0.254 0.378 0.075 0.170 3.2 SDS凝胶电泳图3.初分离蛋白的SDS凝胶电泳M：SM0431 protein marker 1：饱和度45% 2：饱和度30% 5：饱和度60%图4.饱和度60%凝胶层析后不同组分的SDS凝胶电泳M: SM0431 protein marker 1：饱和度60%色谱第一组分2：饱和度60%色谱第二组分 3：饱和度60%色谱第三组分4：饱和度60%色谱第四组分 5：饱和度60%色谱第五组分 6：饱和度60%3.3 MTT检测4.讨论半夏是一种传统的常用中药。近年来的研究发现半夏蛋白在半夏众多的化学成分中具有明显的生物活性

10、，是半夏抗肿瘤和抗生育等药理作用的主要有效成分。本课题用Tris-HCl缓冲液对半夏总蛋白进行提取，再以硫酸铵的不同饱和度对其进行初分离。从紫外可见分光光度法和SDS（图3）的结果可以看出，在饱和度30%至60%之间有大量的蛋白析出，其中从30%到45%析出的蛋白最多。电泳图显示，经过不同饱和度硫酸铵的初分离，总蛋白能够得到一定程度的分离；但是由于含有大量的不同蛋白，导致初分离效果不是很好。所以，接着用凝胶层析对初分离得到的蛋白进行纯化。由于一些客观原因，实验只进行了饱和度为45%和60%的凝胶层析。图2显示，饱和度为60%的蛋白能够进一步地得到分离纯化。最后用MTT法对分离得到的蛋白进行体外

11、细胞试验，检测其体外抑制海拉细胞生长的效果。从图5可知饱和度为60%（组分二）的抑制效果好于饱和度为45%（组分一）的抑制效果。而且图中还显示，0.1mg/ml（45%）的抑制效果低于0.05mg/ml的抑制效果。这可能是由于样品中还含有杂蛋白，不同的蛋白之间相互作用较强，影响其抗肿瘤作用。参考文献1 楼之岑, 秦波.常用中药材品种整理和质量研究( 北方篇)M .北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社, 1995: 9l9- 920.2 李先端,胡世林,杨连菊.半夏类药材氨基酸与无机元素分析J.中国中药杂志,1990, 15( 10):37.3吴皓.半夏姜制对且谷甾醇和总生物碱含量的影响

12、J中国中药杂志，1995，20(11)：6624吴皓.半夏的化学成分研究J.中草药,2003,34(7):5935郭巧生.半夏不同居群3种化学成分的动态比较研究J.中国中药杂志.2001，26(5)：2966 黄必胜.半夏蛋白对人肝癌细胞Bel-7402 的诱导凋亡作用J.时珍国医国药,2007,18 (5):1056.7 梁永恒,刘小川,傅强.两种半夏蛋白及凝集素抑制褐飞虱与番茄花叶病毒初报J. 湖南农业科学,2007,2:93.8 毛子成,彭正松.半夏研究进展J.江西科学,2002,20(1):4246.Pinellia protein Purification and Experimen

13、tal Study on Inhibiting Growth Efects of it on HelaZhou Xupeng,Yang Weixin,Tong Fudan,Xu TaoCollege of Life Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Zhejiang Hangzhou (310018)AbstractPinellia is a traditional Chinese medicine. In recent years, studies have found that Pinellia protein have significant

14、 biological activity in many chemical compositions of Pinellia ternate. And Pinellia protein is the main active ingredient of Pinellia that have pharmacological effects of inhibiting tumor and fertility. Use Tris-HCl buffer to extract total protein of Pinellia ternate, then the different ammonium sulfate saturation were used to salt out the said total protein of Pinellia ternate, foll