本科《食品生物技术导论》课件第二章（1） 基因工程的基本原理及基本过程-

1、中国农业大学食品学院采后生物技术实验室第二章基因工程的基本原理及基本过程主讲教师： 朱本忠2002 年 9 月中国农业大学食品学院采后生物技术实验室食品生物技术对人类的作用解决食品短缺，缓解由于人口增长带来的压力。丰富食品种类，满足不同层次消费人群的需求。（全球人口膨胀，“中国威胁论”）（提高生活质量）中国农业大学食品学院采后生物技术实验室开发新型功能型食品，保障人类健康。生产环保型食品，保护环境。开发新资源食品，拓宽食物来源。食品生物技术对人类的作用（保健食品，功能食品）（减少环境污染，降低腐烂率）中国农业大学食品学院采后生物技术实验室生物工程下游技术现代分子检测技术酶工程发酵工程蛋白质工程

2、细胞工程伦理学电子学分子生物学微生物学生物化学免疫学食品营养学细胞生物学化学工程基因工程食品生物技术研究内容关系树中国农业大学食品学院采后生物技术实验室本章应掌握的主要内容基因工程的概念和主要内容基因工程的原理和关键技术反义基因技术的概念、原理基因工程在食品中的应用中国农业大学食品学院采后生物技术实验室第一节基因工程的基本原理和内容DNA（脱氧核糖核酸）RNA（核糖核酸）基因中心法则一、基本概念中国农业大学食品学院采后生物技术实验室1、DNA（脱氧核糖核酸）由两条极性相反并互补的多聚核苷酸链围绕中心轴的双螺旋结构。2.两条链中的碱基之间按照A配T,G配C的互补原则，以氢键连接。 其中A为：腺嘌

3、呤 T为：胸腺嘧啶 G为：鸟嘌呤 C为：胞嘧啶 U为：尿嘧啶 (RNA)中国农业大学食品学院采后生物技术实验室DNA双螺旋碱基配对图中国农业大学食品学院采后生物技术实验室4.DNA有自我复制的能力。DNA（脱氧核糖核酸）DNA线性排列于染色体上，存在于细胞核中。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室DNA自我复制示意图中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、RNA（核糖核酸）存在于细胞质中分别有三种功能不同的RNA mRNA tRNA rRNAmRNA包含遗传密码，由DNA转录而来中国农业大学食品学院采后生物技术实验室RNA蛋白质反转录转录DNA翻译3、中心法则自我复制中国农业大学食品学院采

4、后生物技术实验室4、有关基因的概念基因是含有一定功能的DNA片段，是遗传的基本单位。获取某段有一定生理功能的DNA片段叫基因克隆。找出某段有一定生理功能的DNA片段在染色体上的位置叫基因定位。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室测定出某段有一定生理功能的DNA片段的碱基序列叫基因测序。按照一定的碱基序列，以核苷酸为原料，合成某段有一定生理功能的DNA片段叫基因合成。4、有关基因的概念中国农业大学食品学院采后生物技术实验室二、基因工程是生物技术的核心内容是现代高新技术的标志之一是世界科学技术革命的重要组成部分Genetic Engineering中国农业大学食品学院采后生物技术实验室解决人类生

5、存和发展的重要手段科学技术发展的火车头1、基因工程（意义）带动农业科学，医学，环境科学，信息科学等学科的快速发展。解决食品保证安全，揭开生命的奥秘，治疗疾病。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室强大的社会伦理冲击力涉及复杂的政治、外交斗争手段人类思想进步的推动者1、基因工程（意义）遗传物质的传递打破伦理限制物种间的平等，解释宇宙生命现象，破除迷信和邪教党派斗争，国际贸易争端中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、基因工程概念 用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成重组体，然后把重组体引入寄主细胞或个体中，使其得到高效表达，最终得到人们所需要的基因

6、产物。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、基因工程的要点切接贴检中国农业大学食品学院采后生物技术实验室产品基因工程基本过程酶切酶切连接转化表达重组体（目的基因）中国农业大学食品学院采后生物技术实验室4、基因工程基本过程 利用重组DNA技术，在体外通过人工“剪切”（cut）和“拼接”（splice）等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行增殖，使重组基因在受体内表达，产生出人类需要的基因产物。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定基因片段或人工合成的目的基因并制备载体。把获得的目的基因与制备好的载体用DNA连接酶连接

7、组成重组体。5、基因工程主要内容1.2.中国农业大学食品学院采后生物技术实验室把重组体转入宿主细胞。筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体和个体。3.4.基因工程主要内容中国农业大学食品学院采后生物技术实验室目的基因的获得 载体的选择6、基因工程的一般操作步骤转基因生物的鉴定转基因重组体的获得导入目标生物体细胞内重组质粒的构建中国农业大学食品学院采后生物技术实验室7、所用的基本实验技术原核生物细胞中克隆载体的提取真核生物细胞中外源DNA的提取目的基因克隆如质粒提取如基因组DNA的提取如PCR技术中国农业大学食品学院采后生物技术实验室所用的技术基本实验技术表达载体的构建基因转化技术转基因鉴定技术如D

8、NA酶切、连接、转化如农杆菌介导的基因转化如Southern杂交中国农业大学食品学院采后生物技术实验室8、所采用的基本工具切接贴检限制性内切酶DNA连接酶载体杂交切割DNA分子连接DNA分子基因转化基因鉴定中国农业大学食品学院采后生物技术实验室9、食品基因工程定义 利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏加工性状以及感官性状的技术。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室10、基因工程的特点可以大大缩短育种年限。生物的基因可以在人类、动物、植物和微生物四大系统间进行交流。对物种定向改造。（常规育种，辐射育种，航天育种）中国农业大学食品

9、学院采后生物技术实验室11、基因工程研究的对象 研究生物大分子，如：蛋白质、核酸、多糖等调节生命过程的物质，包括它们的功能、性状、代谢。 如Bt蛋白，反义抑制基因表达，油脂改良，植物疫苗。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室12、基因工程的发展概况1972年,Berg等首次用限制性内切酶Eco RI切割病毒SV40DNA和噬菌体DNA,组成重组DNA分子。这是首次DNA重组实验。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室1973年，Cohen将伤寒沙门氏菌抗链霉素质粒与大肠杆菌抗四环素质粒在体外重组，获得异源的重组质粒DNA，并把重组质粒导入大肠杆菌中，建立了抗四环素和抗链霉素的重组质粒DNA，

10、标志着基因工程的出现。12、基因工程的发展概况中国农业大学食品学院采后生物技术实验室12、基因工程的发展概况1986年，美国和英国科学家首次进行了抗除草剂转基因烟草的田间实验。此后，基因工程技术迅猛发展，已经在农业、医药、食品、环保等领域显示出巨大的应用价值。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室12、基因工程的发展概况2000年全球的转基因作物种植面积有4420万hm2，为1996年的25倍。转基因作物种植面积最大的前4个国家是美国、阿根廷、加拿大、中国，占全球的99.9%。我国商品化的转基因植物为：转基因耐贮番茄，转查尔酮合成酶基因矮牵牛，抗病毒甜椒，抗病毒番茄，抗虫棉和保龄棉等。中国农业

11、大学食品学院采后生物技术实验室第二节 工具酶和基因载体一、基因工程的工具酶种类：限制性内切酶连接酶核酸酶碱性磷酸酶逆转录酶中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（一）限制性内切酶1、发现：60年代初W.Arber等首次发现。大肠杆菌E.coli BE.coli BE.coli K噬菌体中国农业大学食品学院采后生物技术实验室限制和修饰系统限制作用：一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致其侵染受到限制。修饰作用：寄主本身的DNA由于合成后通过甲基化酶的作用得到甲基化，使DNA得到修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室限制和修饰系统通常，

12、用于基因转化的菌株为：（2）缺乏限制和修饰功能的菌株。（1）缺乏限制功能而具有修饰功能；中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、限制性内切酶的定义在细菌中有一种能够在特定位置上切割DNA分子的酶，这种酶就被称为限制性内切酶。Restriction enzyme, 简称RE中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、限制性内切酶的分类(I,II,III)I型：多聚体蛋白质。作用时需要ATP、Mg2+、SAM。与DNA上未修饰的识别序列相互作用，然后沿DNA分子移动，在1000-5000个核苷酸距离后随机切割单链DNA。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、限制性内切酶的分类(I,II,III

13、)II型：分子量较小的单体蛋白质。作用时仅需要Mg2+即可维持活性。能在特殊位点切割DNA，产生具有粘性末端或其他形式的DNA分子片段。广泛应用于基因工程。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、限制性内切酶的分类(I,II,III)III型：一些具有独特识别方式和切割方式的内切酶。如Mbo II5-GAAGANNNNNNNN-35-CTTCTNNNNNNN-3 识别位点 切割位点N：指任意一个碱基中国农业大学食品学院采后生物技术实验室4、II型限制性内切酶的命名和作用特点命名原则:用具有某种限制性酶的有机体学名缩写来命名。用有机体属名第一个字母（大写，斜体）和种名的前两个字母（小写，斜体）

14、构成基本名称。如果酶存在于特殊菌株中，则还加上菌株名称的符号。最后的罗马数字表示从该菌株中发现此酶的先后顺序。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室命名举例：Hae II从Haemophilus aegypticus中提取的，并且是从中发现的第二种限制性酶。Hin fI从Haemophilus influenzae菌株f中纯化而得的。Eco RI从大肠杆菌Escherichia coli中分离出来的，R表示这种酶的基因在R质粒上。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室作用特点：识别位点序列一般是4个、5个、6个或8个碱基对。识别位点一般都是回文结构。5GAATTC35CTTAAG3Eco RI

15、中国农业大学食品学院采后生物技术实验室作用特点：产生粘性末端或平齐末端。粘性末端平齐末端5GAATTC33CTTAAG55G AATTC3 3CTTAA G5Eco RI酶切(Cohesive ends)5GTTAAC35CAATTG35GTT AAC35CAA TTG3(blunt ends)Hpa I酶切中国农业大学食品学院采后生物技术实验室作用特点：同裂酶 是指来自不同有机体但识别和切割相同DNA序列的酶。 如Hin d III与Hsu I就是同裂酶。同尾酶 指来自不同有机体，并且不同识别序列的酶，但在切割DNA分子后，产生相同的末端，这种酶称为同尾酶。中国农业大学食品学院采后生物技术实

16、验室作用特点：消化条件必须坚持应用推荐的反应条件。当反应条件改变时酶的专一性可能降低，以至同一种酶可识别和切割更多的位点，酶活性发生这种改变，常常在酶上加上星号，简称为酶的星活性。如Eco RI* 中国农业大学食品学院采后生物技术实验室5、限制性内切酶反应的终止适用于大多数限制性内切酶。65 ，温浴5分钟。变性剂：如尿素或SDS。耐热的酶如Bam HI和Hae III。DNA纯化：酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室6、限制性内切酶的主要用途在特异性位点上切割DNA，产生特异性限制性内切酶切割的DNA片段。建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱。构建基因文库。用限制性内

17、切酶切出相同的粘性末端，以便重组DNA。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（二）DNA连接酶能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶。POHPOHPOHOHP催化DNA相邻的5磷酸基和3羟基末端形成磷酸二酯键。粘性平端中国农业大学食品学院采后生物技术实验室1、种类大肠杆菌连接酶需要NAD+（烟酰胺单核苷酸）只能连接粘性末端DNA片段T4连接酶需要ATP能连接粘性末端，也能连接平齐末端中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、影响连接反应的因素温度，离子浓度，DNA末端特性，DNA末端的浓度和分子量。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（1）粘性末端的连接最适连接温度是粘性末端Tm值和DN

18、A连接酶作用最适温度的折中，常用温度为14 。使外源DNA片段浓度比载体DNA高10-20倍，可减少载体自连现象。用碱性磷酸酶预处理质粒载体。（无磷酸基不能连接，而外源DNA片段带有磷酸基）中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（2）平齐末端的连接最适连接温度应接近反应中最小片段的Tm值，但不要超过37。高浓度的ATP会抑制平齐末端的连接。连接反应复杂，速度显著减慢。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（三）DNA聚合酶：负责DNA的复制或合成聚合酶I聚合酶II聚合酶III特性分子量结构基因合成速度3外切活性5外切活性pol Apol Bpol C19000120001400016-20/s

19、2-5/s250-1000+-+大肠杆菌中国农业大学食品学院采后生物技术实验室基因工程常用聚合酶1、大肠杆菌DNA聚合酶I特性用途5-3DNA聚合酶活性3-5外切核酸酶活性5-3外切核酸酶活性切口平移法标记DNA5-3外切活性降解核酸作为cDNA合成引物3端标记进行序列分析中国农业大学食品学院采后生物技术实验室基因工程常用聚合酶2、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）特性用途5-3DNA聚合酶活性3-5外切核酸酶活性随机引物法标记DNA3端末端标记3端标记进行序列分析补平粘性末端cDNA第二条链的合成双脱氧法DNA测序中国农业大学食品学院采后生物技术实验室基因工程常用聚合酶3、T4噬菌

20、体DNA聚合酶特性用途5-3DNA聚合酶活性3-5外切核酸酶活性标记3突出端DNA分子将双链DNA末端转化为平端使结合于模板的诱变引物延伸补平或标记粘性末端5-3外切核酸酶活性中国农业大学食品学院采后生物技术实验室4、T7噬菌体DNA聚合酶特性用途已知DNA合成酶中持续合成能力最强。3-5外切核酸酶活性为Klenow的1000倍用于长片段模板的引物延伸反应通过补平和交换反应进行快速末端标记基因工程常用聚合酶中国农业大学食品学院采后生物技术实验室5、耐热DNA聚合酶（Taq酶）特性用途从噬热菌中纯化而来。5-3外切核酸酶活性聚合酶链式反应（PCR）对DNA片段进行体外扩增DNA测序基因工程常用聚

21、合酶耐热的DNA聚合酶中国农业大学食品学院采后生物技术实验室6、末端转移酶特性用途在DNA分子3端加上多个脱氧核苷酸（A或G或T或C）不需模板，需要Co2+给载体或cDNA加上互补的同聚尾巴DNA片段3末端的放射同位素标记基因工程常用聚合酶中国农业大学食品学院采后生物技术实验室(四）碱性磷酸酶一种是大肠杆菌的BAP一种是牛小肠的CIP催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5磷酸基，产生5羟基。去除DNA和RNA的5磷酸基，经过标记后进行序列分析。去除载体DNA的5磷酸基，防止载体自连。用途特性中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（五）S1核酸酶是特异性单链核苷酸外切酶，能降解单链DNA

22、和单链RNA。去除DNA片段的单链突出端，使DNA成为平端。去除cDNA合成时形成的发卡结构。用S1核酸酶保护实验进行基因表达分析内含子在基因组DNA中的定位。修整渐进性删除突变的末端特点用途中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（六）逆转录酶催化以单链RNA为模板生成双链DNA的反应。RNA指导的DNA合成反应DNA指导的DNA合成反应RNA的水解反应特性用途中国农业大学食品学院采后生物技术实验室RNA蛋白质反转录转录DNA翻译自我复制中国农业大学食品学院采后生物技术实验室二、基因工程载体(vector)能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。在其DN

23、A序列中有适当的限制性内切酶单一酶切位点。具有能够直接观察的表型特征。理想载体应具备的特征中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（一）质粒载体 质粒(plasmid)是一种小的双链环状DNA分子，它们在细胞中能独立于染色体外进行自我复制，并包含各种功能的基因。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室构建质粒载体应考虑的方面分子量尽可能的小。了解载体上基因的位置、限制性内切酶的作用位点。在理想寄主中，载体应该容易繁殖。载体应包含一个可供选择的标记性状，从区别转化细胞和非转化细胞。应最大限度地具有各种限制性内切酶的切割位点。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室举例：pBR332大小为4363bp。

24、含有抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因。抗四环素基因基因里有单一Bam HI,Hind III,Sal I酶切位点。抗氨苄青霉素基因里有单一的Pst I酶切位点。带有一个复制起始位点，在大肠杆菌里高拷贝存在。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室举例：pUC19多克隆位点。含有一个氨苄青霉素抗性基因蓝白斑筛选重组体。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室举例：酵母质粒载体 它既可在大肠杆菌中复制与扩增，又可以在酵母系统中复制与扩增，故又可称为穿梭质粒(shuttle vector)。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室选择酵母载体应考虑的因素：有适当的大肠杆菌和酵母遗传标志。考虑在酵母中的复制方

25、式。在酵母和大肠杆菌中的拷贝数。简单易行的筛选插入物的方式。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室酵母质粒载体种类酵母整合型质粒(Yeast intergrating plasmids,YIp)酵母附加体质粒(Yeast episomal plasmid,YEp)酵母的复制型质粒(Yeast replicating plasmid,YRp)酵母着丝粒质粒(Yeast centromere plasmids,YCp)酵母丝状质粒(Yeast linear plasmid,YLp)酵母表达载体(Yeast expression vector)中国农业大学食品学院采后生物技术实验室酵母表达载体通过酵

26、母表达载体，使外源基因在酵母内表达，产生人们所需的蛋白质。载体包括有效的启动子序列（诱导性或组成性）、目的基因cDNA和转录终止子）产品：乙肝疫苗，胰岛素，水蛭素等。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室举例：农杆菌质粒载体1、根癌农杆菌Ti质粒一般特性： 是土壤微生物根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 中的天然质粒，通过植物伤口，可以侵染广泛的双子叶植物，最终诱导植物伤口组织的增生形成冠瘿瘤，并在冠瘿瘤里合成冠瘿碱。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室农杆菌诱导Ti质粒诱导冠瘿瘤的形成植物DNAT-DNA农杆菌Ti质粒T-DNA冠瘿瘤中国农业大学食品学院采后生

27、物技术实验室冠瘿瘤是农杆菌唯一的碳源和氮源，其他生物不能利用。冠瘿碱包括章鱼碱和胭脂碱。Ti质粒也分为章鱼碱型和胭脂碱型中国农业大学食品学院采后生物技术实验室Ti质粒的重要区域：1.T-DNA（transfer DNA）区域2.vir区域：毒性区3.吸收和利用冠瘿碱的区域4.其他区域中国农业大学食品学院采后生物技术实验室Ti质粒改造原则：保留T-DNA的转移功能。取消T-DNA的致瘤性，使之不干扰植株细胞的正常生长和分化。通过简便的手段可使外源DNA插入DNA之中，并随T-DNA整合到植物染色体上。Vir区域和T-DNA区域可以不在一个质粒上。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室表达载体pB

28、I121-leCTR3示意图中国农业大学食品学院采后生物技术实验室农杆菌质粒载体转化的优点：寄主范围广。操作简单。转化频率高和可重复性高。目的基因能完整的转入受体细胞，整合到植物染色体中，并符合孟德尔定律。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、发根农杆菌Ri质粒 发根农杆菌侵染大多数双子叶植物，并在伤口处引起植物细胞迅速扩增，形成大量根毛。 Ri质粒在结构和功能上和Ti质粒上具有一定的共性。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、植物病毒载体花椰菜花叶病毒(CaMV)雀麦条纹病毒(BMV)双子座病毒(GV)中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（二）噬菌体载体可作为载体，插入10-20k

29、b甚至更大的外源DNA片段，用于构建基因文库，加上很强的增殖能力，有利于基因的克隆。噬菌体是寄生在细菌中的病毒，又称细菌病毒。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（二）噬菌体载体形态结构头部蛋白质DNA+内部蛋白质尾环尾心尾鞘尾盘尾针尾纤丝中国农业大学食品学院采后生物技术实验室1、 噬菌体生命周期溶菌期溶源期噬菌体进入裂解循环，使宿主细胞发生裂解，同时释放大约100个噬菌体颗粒。噬菌体进入溶源循环，注入的DNA整合到大肠杆菌染色体中，与染色体一起复制，不危害寄主。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室一种线状双链分子，长50kb，60多个基因DNA分子包含3个部分左臂：构成头部和尾部外壳蛋白

30、基因。中臂：非必需区，可用于改造。右臂： DNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室被改造过的噬菌体载体一种置换型载体，是可被外源DNA置换的噬菌体非必需区两侧有一队限制性酶切位点的载体。一种插入型载体，是只含有一个限制性位点可供插入外源DNA的载体。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室噬菌体包装过程头前体多连体DNAcos中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、M13载体是一种丝状的特异性大肠杆菌噬菌体，又叫单链噬菌体载体。含有6kb-7kb的单链环状DNA基因组。感染细菌后呈双链复制型DNA。用途：DNA序列分析。制备杂交探针。定点突变中国农业大学食品学

31、院采后生物技术实验室特性：允许包装大于病毒单位长度的外源DNA。感染细菌后，复制环状DNA经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外而不溶菌。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（三）粘粒质粒载体 粘粒是一种含有噬菌体cos区域、抗性基因、单一克隆位点的质粒载体。 它能容纳35-45kb的外源DNA，是构建真核生物基因文库的重要载体。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室第四节 基因工程的基本技术（一）目的基因的获得基本概念： 插入到载体内的非自身DNA片段称为“外源基因”(foreign gene)。 目的基因(objective gene)，又叫靶基因(target gene)，是根据基因的目的

32、和设计所需要的某些DNA分子片段，含有一种或几种遗传信息的全套密码。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室1、鸟枪法染色体DNA大量基因片段连接到载体转入受体菌基因文库筛选单一菌落DNA分离和分析基本过程物理化学繁殖中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、物理化学法 利用核酸DNA双螺旋之间存在着碱基G和C配对、A和T配对的特性，从生物基因组分离目的的方法。密度梯度离心法：单链酶法：分子杂交法：中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、化学合成法4、酶促逆转录合成法利用逆转录酶有mRNA逆转录合成基因的方法。酶促cDNA合成的方法（1，2法见课本，3法用RNA酶H）中国农业大学食品学院采后生

33、物技术实验室提取组织mRNA互补DNA（cDNA）双链cDNA连接到载体转入受体菌cDNA文库筛选单一菌落DNA分离和分析中国农业大学食品学院采后生物技术实验室5、PCR扩增法聚合酶链式反应：Polymerase Chain Reaction, PCRPCR技术由Cetus公司Mullis等人开发的专利技术。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室快速，简便，高度专一性和灵敏度。特点用途生物学，医学，考古学，人类学等。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室反应体系：引物：20个碱基Taq酶dNTPDNA模板反应buffer：Mg2+中国农业大学食品学院采后生物技术实验室PCR反应基本过程：变性：

34、高温下使DNA分子解链。退火：降温使DNA分子重新配对，引物与模板结合。延伸：72 下，Taq酶作用，合成DNA分子30循环中国农业大学食品学院采后生物技术实验室改进PCR：逆转录PCR：锚定PCR反向PCR中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（二）DNA序列测定 是指对某一段DNA分子或片段的核苷酸排列顺序测定，即测定组成DNA分子的A、T、G、C的排列顺序。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室测序方法化学降解法酶促法自动测序法中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（三）目的基因与载体的连接 所谓基因重组(gene recombination)，就是利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和

35、修饰载体DNA和目的基因，并将两者连接起来的过程。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室目的基因的获取连接到载体转化转化基因克隆基因表达筛选中国农业大学食品学院采后生物技术实验室1、亚克隆 把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体，如从重组的 噬菌体克隆到质粒，或从某种质粒克隆到另一种质粒，这种过程称为亚克隆(sub-cloning)。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室亚克隆用到的末端形式改变方法：3凹端补平：3突出端切除：平端加接头：补成粘性末端完全补平S1核酸酶Klenow大片段中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、粘性末端连接同一限制性内切酶位点连接方向随机性载体自连多

36、连体的形成中国农业大学食品学院采后生物技术实验室不同限制性内切酶位点连接方向的唯一性载体不会自连没有多连体现象同裂酶和同尾酶的使用中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、平端连接内切酶如Hae III、Hpa I等切割产生平齐末端。特殊情况下补平或切平。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室连接效率低载体自连多连体方向随机特点任意两个平端均可连接中国农业大学食品学院采后生物技术实验室4、人工接头 人工接头是人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列，将其接在目的基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切酶位点。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室5、同聚物加尾连接是

37、利用同聚物序列之间的退火作用完成的连接。利用末端转移酶杂DNA3端添加同聚物。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（四）重组DNA向受体的转化基因克隆的实质目的基因重组体受体菌的扩增目的基因的大量复制中国农业大学食品学院采后生物技术实验室重组DNA转入受体细胞的方法：1、细菌转化 是指裸露的（或经过纯化的）DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室 凡是能吸收游离DNA片段的细胞，称为感受态细胞(competent cell)，或者说细胞处于感受态。正常生长条件下处于感受态。经过特殊处理才表现为感受态。对转化表现为强烈抵制。中国农业大学食品学院采后生物技术实

38、验室2、磷酸钙沉淀法 利用磷酸钙-DNA共沉淀，把外源基因与 噬菌体DNA分子的重组体导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称为磷酸钙沉淀法。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、体外包装转染法 用未经包装的病毒DNA所引起的转化，特称为转染。重组体噬菌体导入细胞体外包装浸染细菌中国农业大学食品学院采后生物技术实验室4、共转化 将外源基因与报告基因共同导入感受态真核细胞的方法，称为共转化。 整合有报告基因的细胞极易识别和筛选出来，可以确定细胞内是否存在外源基因。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室5、电转化法 也称电穿孔法，即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，是质膜形成纳米大小的微孔，DNA

39、能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室6、基因枪法 它是将DNA分子吸附在由钨或金制作的微型子弹（直径约1m）表面，通过特制的基因枪，将子弹高速射入完整的细胞和组织内。弹药枪电子枪高压气体枪中国农业大学食品学院采后生物技术实验室7、显微注射法 又称微注射法，是创造转基因动物的有效途径。外源基因的制备收集受精卵显微注射植入母体内孕育中国农业大学食品学院采后生物技术实验室显微注射示意图中国农业大学食品学院采后生物技术实验室中国农业大学食品学院采后生物技术实验室优点：可向任何类型细胞导入外源基因。DNA用量极少。注入细胞

40、的DNA分子数可加以控制。整合效率可达50%-100%中国农业大学食品学院采后生物技术实验室8、脂质体导入法 将DNA或RNA包埋于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室9、转化酵母菌醋酸锂法中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（五）植物细胞转化技术 植物细胞转化技术是指将重组DNA通过生物、物理、化学的方法导入植物细胞以获得转基因植物的技术。重组DNA载体转化法基因直接转化法中国农业大学食品学院采后生物技术实验室载体转化法1、农杆菌介导的基因转化1983年1月，比利时的Montagu M. V和美国的Frally R.首先报道。是目

41、前应用最广泛、最成功的转基因技术。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、病毒衍生载体转化优点缺点载体比较小，便于操作高效率感染植物细胞高水平表达外源基因载体容量有限没有证据表明是否能整合到植物基因中外源基因遗传不稳定中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、载体转化的具体方法创伤植株感染法原生质体共培养法叶盘法中国农业大学食品学院采后生物技术实验室植物细胞外源基因的直接转化法 是指不需要载体，而利用物理、化学的方法将外源基因导入受体植物细胞的技术。 在单子叶植物的基因转移中应用较多。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室1、电击法2、基因枪法3、激光微束穿孔法4、细菌圆球体融合法5、多聚物

42、介导法：PEG法6、花粉管通道法中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（六）重组体的筛选与外源基因的鉴定 区分转化细胞和非转化细胞，淘汰未转化细胞。抗除草剂基因抗生素抗性基因：卡那霉素重组体的筛选中国农业大学食品学院采后生物技术实验室转基因检测1、报告基因的检测法报告基因和目的基因一起被转入受体细胞。报告基因是受体细胞本身基因组中不存在的。具有易于检验的表型。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（1）GUS基因大肠杆菌的 葡萄糖苷酶基因D-glucuronidase,GUS5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖醛酸水解产物酶（蓝色）（无色）中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（2）NPTII

43、基因细菌转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶基因。-32P-dCTP新霉素-32P中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（3）CAT基因细菌转座子的氯霉素乙酰转移酶基因。乙酰辅酶A14C氯霉素酶放射性的乙酰氯霉素中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（4）NOS基因农杆菌Ti质粒上的胭脂碱合成酶基因。胭脂碱紫外光下直接检测中国农业大学食品学院采后生物技术实验室（5）LUC基因和GFP基因荧光素酶基因(luciferase)可转化植株发出微弱的光，用灵敏仪器或-光片可直接检测。水母的绿色荧光蛋白(green fluorescence protein)基因产物经一定波长紫外光照射可激发出绿色荧光。中国农业大学食品学院采后生物技术实验室2、PCR检测法从待检植株DNA中是否能扩增出目的基因片段。阳性对照：质粒DNA阴性对照：非转基因植株DNA阴性对照：空白对照快速，灵敏，简便假阳性多，易污染特点中国农业大学食品学院采后生物技术实验室3、分子杂交检测方法探针的制备 基因探针(probe)是一段与目的基因互补的核酸序列，它可以是DNA，也可以是RNA，通过与待册测样品DNA或