几种显示新型隐球菌的组织病理学染色方法的应用比较

1、PAGE PAGE 3作者简介：辛榕，女，重庆市人，副主任技师，主要从事病理技术工作，发表论文20余篇。电话：（023）68765455通讯作者：郭德玉，E-mail:gdy007收稿日期：2009-03-24；修回日期：2009-04-12几种显示新型隐球菌的组织病理学染色方法的应用比较辛 榕，郭德玉（第三军医大学西南医院病理科 重庆，400038）摘要：目的 几种显示新型隐球菌的组织病理学染色方法的比较。方法 采用苏木素一伊红染色（HE）法、PAS染色法、阿尔辛蓝染色法和六胺银染色法对我院尸体剖验的7例新型隐球菌病病例的肺、脑组织进行了染色。结果 上述方法均可显示肺、脑组织中的新型隐球菌，

2、其中在HE染色中，新型隐球菌呈现隐约的淡粉红，轮廓不很明显，较难发现；阿尔辛蓝法显示的新型隐球菌夹膜呈蓝色；PAS法显示的新型隐球菌呈深红色；六胺银法显示的新型隐球菌呈黑褐色，菌壁四周深黑，中间为空白区，镜下极易辨认。结论 六胺银法是显示新型隐球菌效果最好的方法。COMPARISON OF HISTOPATHOLOGICAL STAINING METHODS FOR CRYPTOCOCCOS NEOFORMANS XIN Rong ; GUO De-yu（(Department of Pathology, Southwest Hospital, The Third Military Medic

3、al University, Chongqing ,400038 , China)Abstract：Objective To compare several histopathological staining methods in demonstrating cryptococcus neoforman. Methods Hematoxylin-Eosin (HE) method, Periodic Acid-Schiff (PAS) method , Alcian blue method and Grocott-Gomoris methenamine silver method were

4、applied in the lung and the brain tissue of 7 autoptical cases infected with cryptococcus neoforman . Results Cryptococcus neoforman was demonstrated in all the methods, but it was demonstrated unclear pink body and difficult to be found in HE method, and blue picture in Alcian blue method , and dee

5、p-red body in PAS method, and clear dark black picture and therefore easy to be distinguished from other components in Grocott-Gomoris methenamine silver method . Conclusion Grocott-Gomoris methenamine silver method is the best method in staining cryptococcus neoforman.Key words：Cryptococcus neoform

6、ans;Staining method随着抗生素、免疫抑制剂和糖皮质激素的广泛应用，真菌感染特别是新型隐球菌感染的发病率有明显上升的趋势1,2。因此提高对新型隐球菌病的认识，尤其是提高新型隐球菌的检出率十分重要。目前新型隐球菌的检测方法很多，其中组织病理学检查对新型隐球菌病的诊断具有十分重要的意义。因为肺和脑是新型隐球菌病最常累及的脏器，因此，我们收集了2000年9月至2007年9月间我院尸体剖验的部分新型隐球菌病病例的肺、脑组织进行了苏木素一伊红（Hematoxylin-Eosin ,HE）染色、PAS(Periodic Acid-Schiff ,PAS)染色、阿尔辛蓝染色和六胺银染色，比较

7、上述几种染色方法在检测新型隐球菌时的优缺点，供检测新型隐球菌时提供参考，结果报告如下。 1 材料与方法1.1 材料收集了2000年9月至2007年9月间我院尸体剖验的部分新型隐球菌病病例，其中慢性重型肝炎合并隐球菌感染患者尸体剖验5例，全身播散型隐球菌病患者尸体剖验2例，选取肺、脑组织，10%中性福尔马林固定，常规制作，切片3-5 m.。1.2 方法1.2.1 HE染色法 常规制作。1.2.2 PAS染色法 常规切片，脱蜡至水后，经0.5 g/dl高碘酸氧化58 min，蒸馏水洗，无色品红避光染815 min，不经水洗，擦净组织旁残余染液，0.5 g/dl偏重亚硫酸钠作用1 min，水洗2 m

8、in，苏木精复染30 s，最后脱水、透明、封片。1.2.3 阿尔辛蓝法 常规切片，脱蜡至水，爱先兰液染1020 min，稍水洗，核固红衬染片刻，稍水洗，最后脱水、透明、封片。1.2.4 六胺银法 常规切片，脱蜡至水后，5%铬酸氧化1 h，蒸馏水洗，1%亚硫酸钠水溶液1 min，水洗5 min，入六胺液工作液于60温箱内3060 min，蒸馏水洗，1 g/dl氯化金调色1 min，水洗，2 g/dl硫代硫酸钠处理1 min，水洗，核固红衬染1 0 min，亮绿复染4050 s，最后脱水、透明、封片。2 结果上述方法均可显示肺、脑组织中的新型隐球菌，其中在HE染色中，新型隐球菌呈现隐约的淡粉红，轮

9、廓不很明显，椭圆形，菌壁较厚，中间为空白区，较难发现；PAS法显示的新型隐球菌呈深红色，但着染成份较多；阿尔辛蓝法显示的新型隐球菌夹膜呈蓝色，胞核呈红色；六胺银法显示的新型隐球菌呈黑褐色，菌壁四周深黑，中间为空白区，背景为淡绿色，镜下极易辨认（图1）。经反复实验对比认为：六胺银法显示的新型隐球菌效果最好，其它依次是PAS法、阿尔辛蓝法及HE法。A B C DA：HE染色法；：PAS法；：阿尔辛蓝法；：六胺银法。图1 四种组织病理学染色方法显示肺组织中的新型隐球菌（）3 讨论随着抗生素、免疫抑制剂和糖皮质激素的广泛应用，以及HIV感染和(或)AIDS逐渐增多, 新型隐球菌病的发病率有明显上升的趋

10、势1,2。有统计表明，10%以上艾滋病患者感染新型隐球菌病。由于早期诊断比较困难，晚期又缺乏强有力的药物治疗，新型隐球菌病的病死率很高，故其转归及预后与是否得到及时的治疗密切相关3。因此提高对新型隐球菌病的认识，尤其是提高新型隐球菌的检出率十分重要。新型隐球菌是具有荚膜的酵母样真菌，在自然界中广泛存在，它属于条件致病菌，主要经呼吸道传播，当宿主免疫功能低下时经血传播侵袭中枢神经系统而引起隐球菌性脑膜炎。新近研究发现新型隐球菌有粘液样和光滑2种克隆株，光滑株由于荚膜薄较易透过血脑屏障，并且在体内新型隐球菌慢性感染时，2种克隆株间能进行可逆的基因表型转换4,5 。因此新型隐球菌病最常累及肺和脑等脏

11、器，故本文选取新型隐球菌病患者的肺和脑组织来进行新型隐球菌的检测。目前新型隐球菌的检测方法很多，其中组织病理学检查对新型隐球菌病的诊断具有十分重要的意义。而组织病理学检查中常用的染色方法包括苏木素一伊红染色法、PAS染色法、阿尔辛蓝染色法、六胺银染色法等6-8。PAS染色法的原理是由于新型隐球菌菌壁含有多糖类物质，而高碘酸能氧化其菌壁的多糖而暴露出醛基，醛基与无色品红结合又能生成新的品红复合物，而新型隐球菌通过新合成的品红复合物而显色，背景由苏木素复染，呈现出淡紫蓝色；阿尔辛蓝法常用于鉴别新型隐球菌，因为新型隐球菌夹膜属于黏液物质，对阿尔辛蓝和胭脂红着色，其它真菌和荚膜均不着色，因此阿尔辛蓝染

12、色法对新型隐球菌相对特异，它能将新型隐球菌和与其形态、大小相似的酵母鉴别开来。六胺银法是用5%铬酸氧化新型隐球菌内的多糖化合物而暴露出醛基，醛基还原六胺银成为黑色的金属银，用氯化金调色，把金属银再转化为更稳定的金属金，通过2%硫代硫酸钠处理，除能洗去切片上未起反应的银离子，并可排除组织中的黄色色调。六胺银最大的优点是对各类真菌都很敏感，染色深黑，在镜下极易辨认。本实验中经反复实验对比发现：上述几种方法均能显示新型隐球菌，其中HE染色法显示的新型隐球菌虽轮廓不很明显，不易区别，但它能很好地显示周围组织反应，是新型隐球菌组织病理检查必不可少的染色方法；PAS染色法简便、易行，能很好地显示新型隐球菌

13、，但它还能染组织中的各种糖类，着染成份较多，反差不够强。六胺银法显示的新型隐球菌呈黑褐色，菌壁四周深黑，中间为空白区，效果最好，最容易辨认，但整个染色过程需时较长，且组织结构不能辨认。从显示效果来看，六胺银法显示的新型隐球菌效果最好，最容易辨认，其它依次是PAS法、阿尔辛蓝法及HE法。因此在实际工作中我们可根据需要选用合适的方法。六胺银法和PAS染色法的染色原理均是通过氧化新型隐球菌内的多糖化合物而暴露出醛基和游离醛，但两者的染色效果不同，可能是六胺银染色法中的铬酸比PAS染色法中的高碘酸有更强的氧化能力，暴露出更多的醛基和游离醛。参考文献：1 马军.侵袭性真菌感染的流行病学J.中华医学杂志，

14、2005，85(21):1443-14442 郑瑞强，周韶霞，邱海波等.综合性ICU深部真菌感染的流行病学初探J.急诊医学，2000，9(6):392-3933 Matthew M.,Victoria J.F., and Marin H. K. .Delaying the empiric treatmen of candida bloodstream infection until positive blood culture results are obtained:a potential risk factor for hospital mortalityJ.Antimicrobial A

15、gents and Chemotherapy，2005，49(9):3640-36454 Jain N, Li L, Mcfadden DC,et al.Phenotypic Switching in a Cyrptococcus Neoformans Variety Gattii Strain Is Associated with Changes in Virulence and Promotes Dissemination to the Central Nervous SystemJ. Infect Immun(S0019-9567), 2006,74(2):896-9035 Guerrero A, Jain N, Goldman DL, et al. Phenot